生物有机翻译文献

1、源于大蒜的巯基活性化合物抑制上皮细胞的钠通道Patrick Krumma, Teresa Giraldez b, Diego Alvarez de la Rosa c, Wolfgang G. Clauss a, Martin Fronius a, Mike Althaus a,前言上皮细胞的钠通道（ENaC）是影响跨膜运输钠的一个关键因素，因此也影响到了有机体内盐和水的平衡。ENaC活动失调会导致机体的很多疾病，如高血压、盐浪费综合征、囊肿性纤维化、肺水肿和肠功能紊乱。因此，鉴别影响ENaC活性的新奇的化合物是非常重要的。本文就对大蒜特有的有机硫化合物是否对ENaC有影响进行了研究。人类的E

2、NaC在爪蟾卵母细胞内异源表达，他们的活性是由两个电极电压钳技术测量跨膜电流来判断。从5g大蒜里提取的新鲜化合物减少了爪蟾卵母细胞表达的ENaC的横跨膜电流在10分钟内，这个效果与使用的化合物量有关而且是不可逆的。这是完全敏感的对抑制ENaC的阿米洛利，但对控制卵母细胞不明显。通过二硫苏糖和L-半胱氨酸阻断大蒜的作用表明有巯基活性化合物的参与。大蒜有机硫化合物烯丙基半胱氨酸、蒜氨酸和二烯丙基硫化物对ENaC没有影响。通过对比，源于大蒜的巯基活性化合物蒜素显著的抑制了ENaC。这些数据表明源于大蒜的巯基活性化合物能抑制ENaC。1介绍ENaC是一种异质钠选择性离子通道，它由三个亚基组成、和。EN

3、aCs广泛表达于脊椎动物的上皮细胞，并且代表了跨上皮吸收钠的限速步骤。钠的跨膜运输通过上皮细胞产生渗透压梯度，从而推动水的渗透跨膜运动。ENaCs因此成为调节有机体内盐水平衡的关键因素。在肾脏中，ENaCs表达于远端肾单位和皮质集合管，在那里他们负责钠从原尿的吸收，因此参与了调控全身盐分和水分的动态平衡以及血容量和血压。在肺部，在气道上皮细胞中表达的ENaCs调节呼吸道液的量和成分，并促进肺泡上皮细胞中肺泡液体的清除。在小肠内，ENaCs表达于对醛固酮敏感的结肠中，并且促进吸收沟中的钠和水。这表明，ENaCs对许多器官的生理作用是非常重要的，也暗示了他们的活动必须被精确调控。在病理情况下，这将

4、变得尤为明显。受损的ENaC的调节与人类疾病相关：在肾脏中，一种高血压的遗传形式被称为利德尔的综合征是由于基因突变，从而导致质膜中ENaCs数量的增加。与之相比，突变引起的ENaC功能丧失导致盐耗综合征遗传性假性低醛固酮症 1型。在肺部，增加呼吸道ENaC的活性，可以促进囊性纤维化肺疾病，然而，在远端肺ENaC的活动衰退与肺水肿的形成有关。在肠道内，ENaC的活性受损会导致腹泻。发现新化合物，从而影响ENaC的活动，与上述疾病的生物医学研究密切相关，同时，也是发展一种新型药理工具的先决条件。一个工厂，已深入调查研究了该化合物及其药理潜力，发现是大蒜。在日常生活中，大蒜是一种被广泛使用的调味品。

5、几个世纪以来，大蒜已被确认可以作为一种天然的药物治疗各种疾病，如感染或心血管疾病。大蒜能有这样的益处，是因为其具有抗氧化，抗突变，抗增殖，抗菌和免疫调节的性能。由于其抗菌作用，目前，大蒜正在被研究看其是否能够治疗囊肿性纤维化。在这方面，重要的是探讨大蒜化合物对ENaC的假定影响，由于ENaC的活性较低会导致囊性纤维化的肺部疾病，并且减少呼吸道ENaC的活性，可以考虑作为治疗本病的分子工具。大蒜及其化合物也被认为，可以降低血脂，血浆粘度，血小板聚集，血压等心血管疾病的危险系数。基于ENaCs在肾脏和血压的长期调节之间的联系，可以假设，通过大蒜降低血压，可能是与肾ENaC活性互动的结果。这些例子表

6、明，各种不同的细胞和分子作用归因于大蒜，这可能是病理条件下，也与放松管制的ENaC的活动有关。因此，本文研究了大蒜及其主要化合物对ENaC活性的假定影响。2材料和方法2.1 ENaC的异源表达和微电极记录如前所述，去滤泡膜的光滑的爪蟾卵母细胞生长到阶段V / VI时，用cRNA编码培养用作人类ENaC的三个亚基、和。RNA浓度为5 ng /l每亚基，每个爪蟾卵母细胞被注入18.4nl的体积。注射后24-48小时进行实验。卵母细胞被放置在透明玻璃室内，通过重力驱动系统灌注卵母细胞林格氏液，该溶液含有90mM的NaCl，1 mM的KCl，2mM的CaCl，10mM的4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷

7、磺酸钠盐（HEPES），pH7.4。玻璃毛细血管外径为1.2毫米，被拉到微电极，并填充有1M的KCl。模电压通过双电极电压钳放大器钳位到60mV，跨膜电流（IM）用条状图表记录仪进行连续记录。2.2 准备新鲜的大蒜萃取物生物有机大蒜购于当地超市，用一个标准的厨房打大蒜压榨机，将5g新鲜的大蒜压榨进卵母细胞林格液中，将这个溶液冰浴1h，每10min旋转一次。待提取物均匀分布后过滤，得到干净、水溶的大蒜提取物。大蒜提取物必须每次实验前准备新鲜的，然后用卵母细胞格林溶液稀释至工作浓度（1:100到1：1000）。2.3化学试剂和药品的应用DTT和L-半胱氨酸购于Sigma公司，直接用于卵母细胞格林溶

8、液，浓度分别为10mM和20mM。实验记录过程中，有相同浓度的甘露醇存在，以排除渗透的副作用。蒜素和DATS购于LKT实验室，SAC，DAS，DADS，蒜素和阿米洛利购于Sigma公司。SAC用卵母细胞格林溶液溶解至终浓度为1mM，蒜素用卵母细胞格林溶液溶解至浓度为1M， -20储存，实验时稀释为1mM。蒜素乙醇原液浓度为10mM，-80储存，实验时稀释为100M，与从5g大蒜中提取的提取物浓度近似相等。DAS和DADS每次实验前由原液制备，用DMSO溶解。DATS的制备是由1M的原液用乙醇稀释而来，原液储存于-80。所有的DADS的终浓度都为1mM。实验时有些加了适当的溶剂（DMSO和乙醇）

9、帮助溶解。所有的药物都是在实验前不久用卵母细胞格林溶液新鲜配制的。在卵母细胞中表达的ENaC通过重力驱动灌注系统灌注药物。大蒜素和DATS实验，将含药的溶液注入卵母细胞的腔中，再停止灌注（由于数量药物有限）。孵育10min，将阿米洛利灌注到腔内，用药物溶剂乙醇控制进行。2.4数据分析和统计值表示为平均值标准差，进行统计分析，对照试验的平均值，采用学生T测试，没有对照实验的，采用未对照的学生T测试。当两个以上的团体进行了比较，采用单向方差邦弗朗尼的多次对比试验。用微软excel 2003或Graphpad 5进行统计分析。实验数量表明，从至少两个和n个不同的青蛙卵母细胞作为每个实验的供体。P0.

10、05的被认为是重要的，数据后面以星号标记。3结果3.1大蒜提取物抑制ENaC通过微电极记录非洲爪蟾卵母细胞共同表达的三个亚基、和来研究大蒜对人体ENaC的影响。每个实验开始前，卵母细胞用特定的ENaC抑制剂阿米洛利（10M）灌注，洗脱阿米洛利后，跨膜电流（IM）增加，阿米洛利存在和被洗脱后IM的差值代表ENaC的介导阿米洛利敏感电流（Iami）。大蒜提取物的应用大大减少了IM值，从1.360.27A到0.340.09A，（n= 11，P 0.05），10min后达到稳定条件。随后增加阿米洛利来评估剩余的Iami，在大蒜提取物存在下的Iami与基线Iami相比大量减少。由于大蒜的作用相当慢，故而

11、用不暴露大蒜提取物的ENaC表达卵母细胞进行了相应的控制。一般来说，表达于卵母细胞的ENaCIM随着时间的推移缓慢下降，在爪蟾卵母细胞表达的ENaCs中，这是一个众所周知的现象。因此，10分钟后的Iami分数总是归于基准Iami。与没有大蒜提取物控制记录相比，有大蒜提取物的Iami显著降低64。大蒜提取物的作用是不可逆的，因为在洗出10min后Iami没有增加。在大蒜提取物存在下，标准Iami是0.290.04，洗出10分钟后是0.220.03（n =9，P 0.05）。此外，大蒜提取物的作用呈剂量依赖性，在1:100至1:1000内稀释。在阿米洛利存在下，大蒜提取物的作用被很大程度的阻塞。之

12、前的IM值为0.130.05A，暴露于大蒜提取物10min后，IM值为0.080.04A（n =7，P 0.05）。大蒜提取物对原本的卵母细胞也无作用。总之，这些数据表明，大蒜提取物有剂量依赖性和不可逆抑制爪蟾卵母细胞异源表达的ENaCs。3.2大蒜提取物中的硫醇活性物质参与ENaC的抑制随后进行了调查，大蒜中的哪种化合物负责所观察到的ENaC的抑制，大蒜中含有多种有机硫化合物，这可能会影响ENaC的活性通过与半胱氨酸残基通道的相互作用，在通道门控中发挥了重要作用。这个假设一致，应清理大蒜提取物的效果，通过高浓度自由L-半胱氨酸。20mM的L-半胱氨酸存在时，大蒜提取物失去作用。用半胱氨酸改性

13、试剂DTT作用时也得到了类似的结果。这些数据表明，源于大蒜的硫醇活性可能化合物参与了对ENaC的抑制作用。与之相比，当ENaC被大蒜提取物抑制后，用DTT作用，阿米洛利敏感电流没有显著增加，说明接触大蒜提取物后，DTT不能回复ENaC的活性。3.3大蒜化合物蒜素抑制ENaC大蒜中的典型有机硫化合物是S-烯丙基-L-半胱氨酸，蒜氨酸，蒜素，二烯丙基硫化物。蒜氨酸位于大蒜细胞的细胞质中，并通过蒜氨酸经酶转化成蒜素，然而蒜氨酸经酶位于细胞的液泡中。因此，需要粉碎大蒜，让蒜氨酸经酶与蒜氨酸接触引发转换成蒜素。蒜素和它的分解衍生物二烯丙基硫化物（DAS，DADS和DATS），使它有了独特的刺鼻的气味。按

14、它们对ENaC的抑制能力，对这些化合物进行了筛选。S-烯丙基-L-半胱氨酸，蒜氨酸和二烯丙基硫化物对ENaC没有抑制作用。然而，来源于大蒜提取物的目前的浓度（100M）的蒜素导致ENaC活性锐减，与普通大蒜提取物抑制相比，减少了77%。总之，这些数据表明，大蒜中的巯基活性化合物，有机硫化合物，如大蒜素，抑制了ENaC。4.讨论这里所给出的数据表明，大蒜的剂量依赖性和不可逆的抑制表达于爪蟾卵母细胞的ENaCs，这种抑制作用对巯基改性剂是敏感的，巯基改性剂可以通过目前浓度的大蒜中的有机硫化合物蒜素模仿。大蒜素是一种高活性物质，能迅速通过细胞膜扩散，并已被证明与离子通道，如TRPA1，或细胞内的含巯

15、基的分子，如谷胱甘肽，相互作用。通过大蒜素抑制酶，如蛋白酶，对半胱氨酸残基进行改性。巯基群体对ENaC的功能也是重要的，ENaC的每个亚基包含有细胞外loop环中的半胱氨酸结构域以及细胞内C和N-末端的半胱氨酸残基。特别是细胞内半胱氨酸是通道功能的关键，因为突变或改性这些残基能抑制ENaC的活性。如前所述，可能是通过蒜素改性半胱氨酸最终导致了对ENaC的抑制。这个现象是被实验事实所证实的，当有过量巯基组存在时，大蒜提取物失去作用，L-半胱氨酸和DTT实验也可以证明。此外，大蒜的作用不能被细胞外使用DTT所逆转，这点就使细胞内的半胱氨酸残基改性更利于细胞外的loop环。通过大蒜素改性ENaC亚基

16、细胞内的半胱氨酸残基，代表大蒜如何可降低ENaC活性的分子机制。另外，大蒜素可通过修饰酶，反过来调节ENaC的活动，这将与大蒜作用的慢时程一致。几个世纪以来，大蒜是被公认的治疗各种疾病的天然药物，包括心血管疾病。有益效果是由于大蒜有减少心血管疾病，如血脂，血压，血浆粘度和血小板聚集等危险因素的能力。尤其是大蒜对血压调节的影响，是我们正在进行研究的一个主要焦点。有各种各样的研究调查了大蒜对血压和高血压的作用，包括临床试验。然而，对于大蒜是否确实降低了血压或高血压，是很难做出决定性结论的，这主要是由于临床试验方法的缺陷和缺乏详细的分子数据，而缺乏的这些正是解释假定的大蒜具有抗高血压作用所需要的。大

17、蒜化合物，如蒜素或它的代谢产物对肾脏内ENaC的干扰将会减少钠和水的滞留。这可以解释大蒜治疗各种疾病的有益作用，如与受损钠和水平衡有关的盐依赖性高血压，大蒜可作为一种天然疗法。然而，重要的一点是大蒜的生物利用率。据报道，在所筛选的化合物中，只有蒜素能够模拟大蒜的作用，而代谢产物蒜素，二烯丙基硫化物却没有这样的效果。由于大蒜素的反应活性高，其在体内的半衰期极短，有关蒜素在大蒜内负责的生物效应有相当大的疑问。蒜氨酸酶，这种酶负责蒜素的形成，可能通过胃液的pH值被灭活。相比之下，大蒜素在胃液中稳定，但在血液中不稳定。此外，摄入市售大蒜产品后，人体血液中的大蒜素是检测不到的。这些数据表明，大蒜素是不太

18、可能成为大蒜中的生物活性化合物，而且蒜素是否能够到达原尿和最终的ENaC还是可疑的。因此，必须明确指出，虽然大蒜的ENaC抑制可能意味着假定其抗高血压作用机制，生物化学突出了大蒜介导的ENaC抑制，不利于有关的生理观察。然而，大蒜素的代谢物除二烯丙基硫化物以外，可能存在于体液并且影响肾脏ENaCs。不论其生理意义，仅发现大蒜素抑制ENaC也是药物化学的一个有趣的出发点。大蒜素是一种相对简单的，结构可以修饰的，以提高其生物利用度的有机硫化合物。例如，这样的修饰可以旨在提高在胃肠道通行的稳定性和增加肾脏的渗透性。另外一个挑战是将大蒜素精确的运送到特定的细胞和组织，以抵消由于其高活性带来的毒副作用。在这方面，值得注意的是米