2019年时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程

1、时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程一、产前筛查定义及其原理产前筛查（Prenatal Screening)是指通过经济、 简便和较少创伤的检测方法，从孕妇群体中发现怀有某些先天缺陷胎儿的高危孕妇，以便进而进行诊断，以最大限度地减少异常儿的出生。 血清学标志物产前筛查已成为非侵入性产前诊断的重要方法。目前产前筛查的两种主要疾病是唐氏综合征（Downs Sydrome ，DS；又称 21 三体综合征）和胎儿神经管缺陷（ Neural Tube Defects ，NTDs），也包括一部分 18 三体综合征。产前筛查可以在妊娠早期 （ 7 13 周）或中期（14 21 周）进行。目前用于产前

2、筛查的血清学标志物有：甲胎蛋白（ AFP）、游离 -绒毛膜促性腺激素（ F- -hCG）、游离雌三醇（uE3）、妊娠相关血浆蛋白（PAPP-A）、抑制素 A（inhibin A）等。产前筛查实验测量通用评价指标为中位值倍数 （MOM），正常妊娠特定的 MOM=标本检测浓度 / 相应孕周中位值浓度。 产前筛查系统由体外诊断试剂、检测仪器和筛查分析软件组成。 检测仪器配合体外诊断试剂检测出孕妇血清中标记物（ AFP、F- -hCG、PAPP-A等）的浓度，将检测数据及孕妇相关因素输入筛查分析软件中，即可得出唐氏综合征（ DS）和神经管缺陷（ NTD）筛查的结果。由于目前的技术水平的限制，产前筛查技

3、术都不能做到筛查 100%正确。假阴性病例因此会误诊，假阳性病例一般在产前诊断实验时被纠正。二、唐氏综合征的产前筛查唐氏综合征是人类最常见的一种染色体病，发病率约 1/800 1/600 ，男性多于女性。 1866 年英国医生 LangdomDown 首次对此病进行临床描述，因此命名，称为 Down s Syndrome，简称 DS。1959 年 Lejeune 首先发现本病的病因是多了一条 21 号染色体，故又将其命名为21 三体综合征。唐氏综合征的主要临床表现：严重智力低下、愚型面容，约50%伴有先天性心脏病、小头畸形等发育异常。目前对 DS尚未有治疗方法，因此通过产前筛查找出高危孕妇，对

4、其进行产前诊断是防止患儿出生的重要手段。1. 以孕妇年龄作为筛查指标最早用于 DS的筛查指标为孕妇年龄。早期研究发现， DS的发病率随孕妇年龄增高而增高， 1977 年 Hook 和 Chambers报道了孕妇年龄在 20 30 岁之间，发病率呈线性增加，而在 33 岁左右呈对数增加，孕妇年龄为 35 岁时，发病率约 1/384 ，40 岁时约 1/110 ，比 30 岁时增加了 8 倍，如图 1。一般认为 35 岁以上1的孕妇是 DS的高危人群，是要进行羊膜腔穿刺的指征。但深入研究统计发现，若仅以孕妇年龄 35 岁作为筛查指标， DS的检出率约 20%，而约 80%的胎儿 DS 是在年龄小于

5、 35 岁的孕妇人群中。 因此，不少国家的筛查机构指出 “ DS 产前筛查应面向所有孕妇而不考虑年龄” 。仅用孕妇年龄指标不够全面，应结合应用孕妇血清标志物指标或超声波形态学联合筛查诊断。图 1 孕妇年龄与胎儿发生唐氏综合征风险的关系2. 以孕妇血清标志物为筛查指标1984 年英国 Merkatz 等最先发现怀有DS胎儿的孕妇血清AFP含量降低，这在产前筛查史上是一个划时代的进步，建议将AFP 作为 35 岁以下孕妇胎儿DS的筛查指标。这一发现很快被其它实验室证实， 1987 年 Bargot 发现怀有 DS胎儿的孕妇血清中的 hCG的水平是正常孕妇的 2 倍，以孕妇年龄再结合血清中 hCG

6、检测，DS的筛查率可达到 63%。1988 年，Canick 等发现怀有 DS胎儿的孕妇血清中 uE3 的水平比正常孕妇低 25%。同年，伦敦 Bartholomews 医院 Wald 提出 AFP、?-hCG、uE3 三联的筛查方法。 1994 年美国妇产科学院向全美医学界正式推荐这一组合，并得到广泛应用，一直至今。在上世纪 90 年代，有学者还相继发现PAPP-A、 inhibin A、糖原抗原 125（CA-125）等与孕妇怀 DS胎儿有关。也将逐步应用到 DS的产前筛查中。甲胎蛋白（ AFP）是胎儿血清中最常见的蛋白质，1956 年由 Bergstrandh和 Czar 在人胎儿血清中

7、发现的一种甲种球蛋白。早孕期由卵黄囊产生，晚孕期由胎儿肝脏大量产生。胎儿血中的 AFP 经排尿进入羊水并通过胎盘屏障渗入母血。孕 10 周即可在母血中测出 AFP，孕 11 20 周 AFP浓度呈线性升高， 3234周（有文献为2832 周）达到高峰，以后逐渐下降，分娩后几天降为0。且孕早期以 AFP单项筛查胎儿染色体异常无意义，因此母血中AFP的检测在孕中期21420 周进行。正常孕妇血中AFP含量变化见图2 与表 1。当孕妇胎儿患 DS时，由于胎儿生长发育迟缓，组织器官发育不全，肝脏、胎盘的功能不良，合成 AFP能力降低，致使孕中期母血清 AFP水平下降（一般<0.5MOM，有的以

8、<0.4MOM或<0.7MOM为标准）。但当胎儿出现开放性神经管缺损或腹壁缺损时，破坏了阻止 AFP外溢的胎儿屏障，使胎儿体内高浓度的 AFP释放，渗透入母体循环，引起母体血清中的 AFP显著升高。因此， AFP也可作为神经管畸形的筛查指标。正常妊娠母血中 AFP含量（ ug/L ）随孕周的变化） 250.00L/200.00gu（ 150.00量 100.00含PFA50.000.0010152022242628303234363840孕周参考：马云宝，顾军，何雪云. 医学特种检测的临床应用，第1 版 . 北京：原子能出版社，1-2.图 2 正常妊娠母血中 AFP含量变化趋势表

9、1 正常妊娠母血清 AFP含量参考值（ ug/L ）孕周中位数0.4MoM 0.7MoM 2.0MoM 2.5MoM14-1541.2616.5028.8882.50103.1516-1754.1521.6637.91108.30135.3818-1969.2727.7148.49138.54173.1820-2191.5836.6364.11183.16228.9522-23127.6251.0589.33255.24319.0524-25155.1162.04108.53310.22387.7826-27190.3976.16133.27380.78475.9828-29252.80101

10、.13176.96505.60632.0030-31250.72100.29175.50501.44626.8032-33321.07128.43224.75642.14802.6834-35203.1681.26142.21406.31507.8936-37184.9273.97129.44369.84462.3038-39226.6890.67158.67453.35566.6940-42140.4156.1698.29280.82351.03摘自：方群 . 妇产科检验诊断学，第1 版. 北京：人民卫生出版社，62.绒毛膜促性腺激素（ hCG）是胎盘的合体滋养层分泌的一种糖蛋白，为胎盘中最

11、重要的激素， 由 和亚基组成， 两个亚基可彼此结合， 也可游离于血液3中。孕妇血清中的 hCG主要以完整的形式存在，游离形式的 -hCG（ F- -hCG）占总 hCG的 18%。妊娠期母血清中 -hCG水平呈双峰曲线，第 1 峰于妊娠 12 周前后（一般 810 周或 912 周），15 周后出现生理性下降， 20 32 周维持低而平稳水平， 26 周达最低。第 2 峰于妊娠 37 周，明显低于第 1 峰，至妊娠足月时稍有下降。在妊娠 11 周内，血清 -hCG的含量与孕龄密切相关，随妊娠进展呈直线上升，孕龄每增加 1 天， -hCG平均增加 1.53IU/ml （hCG约每 1.3 天上升

12、 2 倍，如未达到此水平， 此次妊娠可能是输卵管妊娠宫外孕， 应动态观察），分娩后急剧下降，产后 4 天降至 1 IU/ml ，产后 9 天基本消失。正常妊娠母血清hCG含量见表 2 与表 3。胎儿患 DS时，胎盘重量低于正常水平，组织器官发育不全，肝脏、胎盘的功能不良，因此孕妇血清中 hCG浓度下降要比怀正常胎儿的孕妇晚3 周左右，致使孕中期（约 20 周左右）母血清中的 hCG浓度呈高水平状态， 怀 DS儿孕妇血清中游离的 -hCG浓度比正常孕妇至少高2 倍（一般 >2.5MOM），如图 3。表 2正常妊娠母血清 hCG含量参考值（ U/L）妊娠期（周）受精后距末次月经U/L2451

13、00352003000461000080000512714900005000001324152650008000026382740300015000摘自：周新，涂植光 . 临床生物化学和生物化学检验，第3 版 . 北京：人民卫生出版社，435.表 3正常妊娠母血清 -hCG含量参考值（ mIU/ml）孕周 1-hCG孕周 2 -hCG孕周 2 -hC7 ±3304.92018568.7 ± 3718.22421001456146±24314.92118046.1 ± 6691.531065001548704.5 ± 3

14、3045.52220174.2 ±15022.346310001638275.4 ± 21572.42322282.3 ± 5493.35150100001729620.6 ± 11921.42416393.1 ± 4735.371000150001828100.5 ± 11952.82519403.9 ± 7825.39121200200001929392.4 ± 13482.82617455±9505.5摘自： 1. 韦振元等 . 血清 -hCG、 HPL和-hCG/HPL 比值对妇产科疾病的临床意义

15、. 标记免疫分析与临床，1999，6（1）： 9-12.2. 王晓雯等 . 孕中期各周 -hCG正常值测定及其临床意义. 中国优生与遗传杂志，2000，8（ 2）：62.4图 3?-hCG在正常孕妇和怀有唐氏胎儿孕妇血清中的分布游离雌三醇（ uE3）是雌二醇（ E2 ）和雌酮（ E1）的代谢产物，在非妊娠女性中浓度很低，而在妊娠后期浓度则明显增加。只有约9%的 E3 在血液循环中游离为 uE3。在妊娠后期 E3 由胎儿肾上腺、胎肝和胎盘大量合成，反映了胎儿和胎盘双方面的功能。母体血清 E3 约 90%来自此合成途径，少量由母体卵巢前体生成。E3 生物合成途径的中断将导致母体血清E3 低水平。造

16、成E3 途径中断的情况：胎儿宫内发育迟缓、无脑畸形、胎盘硫酸酯酶缺乏、死胎、染色体异常等，缺乏E3 的孕妇分娩期将推迟。在胎儿正常发育的情况下，其母体内uE3 含量自 2934周逐渐上升， 3536 周开始快速上升，在4142 周（ 3738 周或 4041 周）达高峰，正常妊娠孕妇uE3 参考值见表 4 与图 4。uE3 被用于胎儿 DS筛查主要在孕中期，应注意正常妊娠孕妇uE3 是孕中期变化最大的指标，必须核对孕周。在孕妇怀DS 胎儿时，母体血清中uE3 表现为降低异常（一般 <0.7MOM）。目前 uE3 已是多标记联合筛查中用得相当普遍的标记物之一。表 4正常妊娠孕妇血清uE3

17、参考值 (±s, g/L)孕周例数FE孕周例数FE331762.2 ± 0.6302011.2 ± 2.718443.7 ± 1.1312312.3 ± 2.719344.8 ± 1.4322614.6 ± 3.520305.6 ± 1.5331621396.6 ± 1.8341122396.6 ± 1.835923418.0 ± 2.136915.2 ± 3.924338.3 ± 2.2371215.0 ± 4.225268.8 ± 2.038

18、1117.0 ± 3.726418.8 ± 2.6391324.7 ± 7.127298.8 ± 2.5401925.9 ± 8.628258.9 ± 2.4411036.9 ± 7.029279.6 ± 2.4引自：徐增秀, 徐燕红 , 彭晓燕 ,等 .正常孕妇血清游离雌三醇动态监测的临床价值.标记免疫分析与临床,2000,7(2): 74-75.530uE3 25浓 2015 度 10g5/L017202326293639孕周图 4 正常妊娠孕妇血清 uE3 含量变化趋势妊娠相关血浆蛋白（ PAPP-A）是一种

19、大分子糖蛋白， PAPP-A 由胎盘合体滋养层和蜕膜产生，属于2 巨球蛋白，具有激活补体，起免疫抑制的作用（其生物功能目前尚未完全清楚）。早在1974 年 Lin等首次报道了孕早期母血中PAPP-A的研究，指出 PAPP-A起源于绒毛周围纤维蛋白，其水平随孕周增加而增加。后来诸多学者分别在孕早期应用PAPP-A结合 F- -hCG（或 hCG）作为 DS筛查指标，证实PAPP-A是一种最有意义的标志物。Wald 等及 Haddow等在综合归纳了 9 个国家 21 个产前筛查诊断中心的研究结果的基础上，用孕妇7 种血清标志物以不同组合作筛查指标进行比较，结果显示，PAPP-A诊断 DS效果较满意

20、，特别是结合F- -hCG 组合时阳性检出率可达60%，其中假阳性率仅为5%。Zimmermann等检测了 1151 例 21 三体和 18 三体患者的 PAPP-A水平，中位数的倍数分别是 0.51 和 0.08 ，结果显示 PAPP-A可作为妊娠 DS胎儿产前筛查一个独立的标志物。孕早期就可以在母体血清中检测到 PAPP-A（单胎受精后 32 天，双胎受精后 21 天即可在孕妇血清中检测到），随着妊娠进展，母体 PAPP-A水平升高，到妊娠足月时达到高峰，此时母血 PAPP-A浓度是羊水的 10 倍，产后 6 周即测不到。而整个妊娠期间，胎血中测不道 PAPP-A，这是因为 PAPP-A分

21、子量大，不能透过胎盘进入血循环。 PAPP-A具有以下优点：在孕早期阶段，母血中即可测到。当其他妊娠蛋白水平开始下降时，母血PAPP-A水平仍在升高，它是唯一的一种在母血中浓度最高，羊水中次之，胎血中不含有的妊娠蛋白。由于DS胎儿的器官包括胎盘均发育不全，胎盘合体滋养层功能下降，合成PAPP-A减少，因此怀有DS胎儿的孕妇，其血清中 PAPP-A一般低于 0.25MOM0.51MOM。在孕早期低水平的 PAPP-A是筛查染色体异常胎儿的很好指标，尤其是 DS胎儿，阳性检出率可达666。此外，有自然流产、异位妊娠、胎儿生长迟缓、胎死宫内时，孕妇血清PAPP-A 亦呈低值，这与胎盘功能不全，使其合

22、成减少有关。正常妊娠孕妇血清PAPP-A参考值见表 5 与图 5。该指标在孕早期较为敏感，检测PAPP-A前最好以 B 超检查确定孕龄，孕14周后 21 三体妊娠与正常妊娠无明显差别， PAPP-A的最佳筛查时间为妊娠1014周， <0.5MOM应作产前诊断。 PAPP-A<0.5MOM也可见于胸腹腔积液、双肾积水、腹水、羊水过多、死胎等；PAPP-A>2.5MOM可见于唇裂、尿道下裂等。表 5 正常妊娠孕妇血清 PAPP-A参考值（ mIU/ml ）孕周平均数中位数0.5 倍中位数2.5 倍中位数40.0080.0120.0060.03050.0740.0340.0170.

23、08580.7840.3210.1600.805114.9463.2691.6348.1731411.37410.8805.44027.2001716.25315.7837.89239.4582022.39221.92010.96054.8002326.07625.82012.91064.5502624.67426.63513.31866.5882930.36127.21013.60568.0253228.88829.54014.77073.8503535.10831.31015.65578.2753834.23337.36018.68093.4004131.76534.46017.23086

24、.150引自：章晓梅，李春华，冯怀英，等 . 孕妇血清 PAPP-A蛋白测定早期筛查染色体病 . 中国优生与遗传杂志，2001，9（2）：24-38.100.00080.00060.000系列 1系列 240.000系列 320.000系列 40.0004581114172023262932353841孕周注： 4-41 周孕妇血清 PAPP-A浓度曲线，系列1 为浓度平均数，系列2 为中位数，系列3 为 0.5 倍中位数，系列 4为 2.5倍中位数。图 5正常妊娠孕妇血清PAPP-A含量变化趋势7抑制素A（ inhibin A）被认为是一个由合胞体滋养层产生的化学物质，1992 年有学者开始

25、研究其与 DS胎儿的相关性，研究发现孕妇血清中与 DS胎儿相关的主要物质是二聚体抑制素 A。Aitken 等研究发现，在妊娠 78 周检测二聚体抑制素 A，怀 DS胎儿的孕妇血清中二聚体抑制素 A 浓度较正常孕妇的高出 2 倍。进一步结合 AFP、hCG能大大提高 DS的检出率，在一些多标记联合筛查中发现其作用不可忽视，甚至超过uE3 的趋势。糖原抗原 125（ CA-125） 为一种大分子量糖蛋白，其生理功能目前尚有争议。 1990 年 Cherk 等报道孕早期孕妇血清中糖原抗原 125 水平高于正常值，可能与胎儿自发流产和 DS有关。 1997 年 Wenstrom 等用研究数据统计表明，

26、这一标记在筛查 DS 胎儿时，其阳性率可达 45%，并认为这一标记可用于多标记联合筛查。三、胎儿神经管缺陷的产前筛查胎儿神经管缺陷（ Neural Tube Defects ，NTDs）是出生缺陷最常见疾病类型之一，其发病是由于受精后 2024 天内神经盘折叠过程中神经管不能闭合导致的。多数的神经管缺陷是开放性的， 神经组织完全暴露或仅仅盖有一层薄薄的透明膜；只有极少部分损伤是闭合性的， 神经组织由皮肤或一层很厚的膜完全覆盖。无脑畸形、脊柱裂、脑膨出是神经管缺陷三种主要类型。1977 年首次报道血清中 AFP水平升高和开放性神经管缺陷畸形有关，因为开放性损伤时胎儿体内高浓度的 AFP有可能通过

27、胎儿血液循环到达羊水， 再通过羊膜渗入母体循环， 引起母体血清中的 AFP显著升高。因此通过检测孕妇血清中AFP浓度可以进行神经管缺陷的产前筛查，可以检出 8090%的开放性神经管缺陷。在英国，由于开展了神经管缺陷胎儿血清筛查， 其神经管缺陷胎儿的出生率从 1960 年的 1/350 降至 1987 年的 1/2500, 下降了 86。结果说明 AFP是一个很有效的神经管缺陷筛查指标（一般 >2.5MOM，它在筛查胎儿神经管缺陷中的作用是其它标志物无法替代的） 。四、 18- 三体综合征的产前筛查18 三体综合征可以用孕妇血清联合筛查， 怀有 18 三体综合征胎儿的孕妇孕中期血清 hCG

28、、AFP和 uE3 水平降低，以 AFP0.75MOM；hCG0.55MOM；uE30.60MOM为切割值， 18 三体综合征胎儿阳性检出率可达出 6080%。8五、产前筛查血清标志物的联合应用产前筛查各种不同血清标志物筛查特性见表6。表 6各种不同血清标志物筛查特性血清标志物来源适用孕周阳性表现阳性检出率筛查胎儿缺陷使用评价21 三体，作用肯定，AFP胎肝1521NTDs30%各种三体综合征， NTDs普遍应用作用肯定， -hCG胎盘82121 三体51%各种三体综合征普遍应用胎儿肾上腺，作用有争议，uE3肝脏，胎盘142121 三体30%各种三体综合征应用较普遍作用肯定，PAPP-A胎盘合

29、体滋养层81421 三体54%各种三体综合征普遍应用胎盘合体滋养层，作用有争议，INH A黄体142121 三体41%各种三体综合征应用渐增多21 三体综合征：妊娠中期母血 AFP下降， uE3 下降， F- -hCG上升（三联筛查方法）。PAPP-A 和 F- -hCG 在妊娠 10周左右有较大价值， PAPP-A 下降，F- -hCG上升，检出率达 63%，这个组合已成为孕早期筛查最佳组合。 有学者认为四联筛查方法（ AFP，uE3，F- -hCG， INHA）的检出率优于三联筛查方法。神经管缺陷：孕早期母血AFP和 F- -hCG正常， PAPP-A下降；孕中、晚期PAPP-A明显下降，

30、 AFP上升。18 三体综合征（ Edward 综合征）：PAPP-A和 F- -hCG 具有孕早期筛查18三体综合征的价值，母血F- -hCG 和 PAPP-A下降；孕中期， 18 三体综合征母血 AFP下降， uE3 下降， F- -hCG下降。13 三体综合征（ Patau 综合征）：血清标志物变化与是否合并神经管缺陷有关。Turner 综合征：妊娠中期 uE3 下降， AFP改变不明显或增高。如有胎儿非免疫性水肿 hCG上升，否则 hCG下降。染色体三倍体：当为69 条染色体时，血清标志物变化各不相同，一般认为AFP上升， uE3 下降， F- -hCG或高或低。死胎：孕早期和孕中、晚

31、期死胎，母血F- -hCG和 PAPP-A均明显下降（胎盘功能破坏），而 AFP升高（胎肝合成的AFP溢漏）。多胎： AFP、uE3、F- -hCG均升高。9六、产前血清标志物筛查的影响因素影响血清标志物的因素较多， 易造成假阳性或假阴性， 需采取措施予以纠正。1孕周估计误差：妊娠周龄对筛查结果计算十分重要，计算方法有两种：由末次月经（ LMP）日期来推算，这种方法对月经周期规律者较好，但对月经周期不规则者不适用。超声波测量胎儿的双顶骨间径 (BPD)是较正确的方法。当两种方法计算怀孕天数误差超过 10 天时，则以 BPD为准；不足十天的两法均可。2. 多胎的影响：双胎或多胎妊娠时，血清生化指

32、标明显高于单胎妊娠。双胎的DS检出率要低于单胎。3. 孕妇体重：孕妇体重过重由于稀释作用可使 AFP、 uE3、hCG水平降低。4. 母亲自身疾病：孕妇患有一些其他疾病时，可影响生化指标。如孕妇为胰岛素依赖性糖尿病时，母血清 AFP比正常同孕周孕妇低 20%，而 uE3 和 hCG水平升高。5. 母亲吸烟：孕妇吸烟使 AFP升高 3%， hCG降低 3%，uE3 降低 23%。6. 种族差异：不同种族的人群正常值不同， AFP 在亚洲及黑人的水平较西班牙人和白种人高， hCG在非裔美国人中较高。因此，不同种族人群应建立自己的正常值7. IVF 与自然妊娠相比， hCG明显升高而 AFP明显降低

33、。七、产前筛查流程产前筛查流程：（遗传咨询），收集资料，采集血样，检测，风险评估，报告结果，病例追踪，遗传咨询，存档。如图6、图 7 与图 8。图 6产前筛查流程图10图 7 唐氏综合征（ DS）产前筛查流程图图 8 神经管缺陷（NTD ）产前筛查流程图八、产前筛查时间分辨荧光免疫分析法实验操作常规1. 时间分辨荧光免疫分析法试剂盒检测原理： 目前已应用的有标记抗原与未标记抗原（待测或标准品）竞争结合抗体的竞争法、固相抗原与游离抗原（待测或标准品）竞争结合标记抗体的竞争法和固相双位点夹心法等。 应用较多的为固相双位点夹心法， 如夹心一步法和夹心两步法。 方法简便，可以得到满意的灵敏度和特异性，

34、批间批内变异系数小，精密度高。 TR-FIA 夹心两步法的检测示意图如图 9。图 9TR-FIA 夹心两步法的检测示意图112. 时间分辨荧光免疫分析法实验室检测流程： 如图 10。采用 TRFIA 试剂二联法 AFP+HCG（F- -HCG）报筛查项目及实告唐氏综合征风险率及神经管缺陷的风险率。验步骤简介（详见说明书）主要实验步骤试剂盒复温标记物的稀释加样加入标记物工作液振荡孵育洗涤反应板加入增强液仪器检测实验室检测实验室质量控制目的 :保证每个孕妇样本的测定结果的稳定性、可靠性手段 :1. 室间质评系统误差准确度2. 室内质控随机误差精密度室内质控是实验室质量控制的基础, 提高常规测定工作

35、的批间、批内标本检测结果的一致性。“室内”质控失控情况处理及原因分析1、填写失控报告单上报实验室负责人。2、由负责人作出是否发报告的决定。3、分析失控原因重做同一质控物（人为差错、偶然误差）新开一瓶质控物（质控物使用、保管）重新校准（校准错误）进行仪器维护，更换试剂（仪器、试剂）请专家帮助4、完成失控报告单系统误差原因分析1、样本采集及方法或试剂分配器（加样枪）不正确的调整；2、实验区域不恰当温度/ 湿度水平；3、试剂或校准物批号改变；4、使用、保存或运输过程中试剂变质；5、使用、保存或运输过程中校准物变质；6、使用、保存或运输过程中质控物变质；7、控制物非正确处理（冰冻）；8、在无霜冰箱中控

36、制无不恰当的保存；9、在实验系统中使用非试剂级别的水；10、仪器滤光片轮脏或光源减弱；11、仪器设备近来校准；12、实验操作人员变换。图 10时间分辨荧光免疫分析法实验室检测流程123. 仪器操作流程与注意事项仪器操作流程： 开机软件注册软件登录软件使用 （进入测试模块选择实验项目新建测试板孔测试拟合分析） 退出软件关机填写 仪器操作记录，具体操作如下：1. 打开半自动时间分辨荧光免疫分析仪 ( 后下方绿色按键 ) 仪器后面电源开关，再按下泰莱 -I 前面的白色按键启动计算机。2. 打开半自动时间分辨荧光免疫分析仪右边的测试电源开关( 绿色按键 )3. 打开电脑桌面 TALENT-I 图标，进

37、入软件登录界面 .4. 在登录界面中输入登录编号“ 1”，再输入登录密码“ 1”.5. 在进入半自动时间分辨荧光免疫分析仪软件主界面后，按如下指示操作：屏幕显示具体操作界面右边显示“测试，报告，质控，点击“测试”，进入下一界面历史，设置”界面左上方显示编号，项目类型，项选择项目类型和项目名称后，进入右边新目名称建测试界面，并选择最后一块板的结束孔如： 1. 类型：甲状腺类2. 名称： T3位，点“确定”，系统自动产生实验批号和实验板号，点“板孔测试”界面右边显示您所要测试的蓝色背点界面右下角的“测试” ，仪器开始测试，景试管摆放图测试完后点“板孔设定”显示“设定为标准品”，“设定为质填入试管摆

38、放起始位 . 如第几排第几管 . 若控”，“设定为样品” .做曲线，需点击“设定为标准品”，并选好“复管数”；若做质控，则点击 “设定为质控”并选好高，中，低三种类型 . 在“设定为样品”一栏中，选好样品的起始位置，输入样品数，用 1 到 N 表示 . 每完成一项请点击“确定” .完成上述步骤后 , 点击“拟合分析” ,在“使用自测标准点进行拟合或校准”前界面右边显示有“拟合, 曲线 , 结果 ,打“” , 即可得到测试分析后的曲线, 点打印 , 保存” , 中下边有“使用自测标击“拟合” , 得到测试浓度 , 要看曲线分析准点进行拟合或校准”情况 , 点击“曲线” , 拟合得到结果后点击“打

39、印”即可以打印测试结果.6. 上述操作全部完成后 , 点击有整个界面右下角的 “退出” , 即可退出 TALENT-I软件 .7. 关闭 TALENT-I 检测仪电脑主机部分及显示器的电源开关 , 然后关闭测试电源开关 , 最后关闭 TALENT-I 仪器的总电源开关 .8. 填写相关记录。注意事项：按照上面规定的开机和关机顺序进行开关机，以免损坏设备； 进13行具体的测量前，保证检测仪部分开机预热 30 分钟以上；出现故障时可以参考“故障排除”一节的内容进行排除； 出现不能解决的问题时， 请及时与我公司售后服务部联系。4. 实验操作与注意事项： 以 AFP和 F- -hCG为例，见下表 7。

40、1）. 资料收集常规资料收集是最关键基础的一步， 直接影响检测结果的分析。 完整的资料包括：孕妇姓名、出生日期、联系地址电话、孕周、体重、末次月经日期、月经是否规则、是否吸烟、胰岛素依赖型糖尿病、 曾出生先天愚型、 双胞胎。还有采样日期，因为绝大部分是采用末次月经来推断孕周的。影响因素与建议： 对于月经不规则的孕妇， 为了得到准确的孕周信息， 要求其做 B 超确定孕周。 必须要有孕妇的签名， 规避潜在的危险。 个体差异可能导致漏检。2）.血样采集常规采集时间：孕早期： 7-13 周；孕中期： 14-21 周。采集的量： 3-5 毫升静脉血即可。标本保存：分离血清，4可保存 5 天左右；条件允许

41、 -20 冷冻保存。影响因素与建议：（1）标本中的 hCG随时间延长和温度增高会分解为 亚基和 亚基。由于游离的 亚基在血清中含量非常低，分解出来的 亚基会在很大程度上影响 亚基的检测水平，而对完整的hCG的影响则相对较小。因此用 亚基作为指标有可能增加假阳性率。为此实验室在运输或保存标本时要近量避免温度的升高。有学者研究表明，30 6h 或 35 2h 即可使项目浓度明显提高，血标本应及时分离（采用3000rpm 6min 以上或 2000rpm 15min），分析时室温较高且标本较多， 建议将标本置于泠水浴中。（2）本试剂采用的是一步法，不能采用血浆标本， EDTA、柠檬酸盐等螯合剂会影响

42、铕标记的稳定性，使荧光值偏低。（ 3）标本避免反复冻融，会使检测物质活性（效价）降低。对溶血、黄疸、脂血等标本应在报告单上注明， 特别含大量脂质、 严重黄疸及溶血或加热灭活之标本均可能影响检测结果， 可建议重新采血。 已稀释的血清不宜存放， 稀释样本应先加稀释液，再加样本，避免非特异性吸附。3 ）. 试剂准备（1）微孔反应板：将试剂及所需数量的微孔反应板条平衡至室温（ 2025）。余下的微孔板条及时置入自封袋密闭并于 2 8保存。14（2）洗涤液：将 40ml 浓缩洗液和 960ml 蒸馏水在干净的容器中混合， 作为工作洗涤液备用。蒸馏水敬请用户自备。（3）标记物工作液： 使用前配制， 将 h

43、AFP或 F-hCG标记物与实验缓冲液按体积比 1：100 加进洁净的一次性容器中并混匀，当次试验用完。影响因素与建议：（1）免疫反应受温度影响，在一定范围内随温度的提高，反应加快。平衡温度可保证实验反应的均一性。 （2）配置试剂采用去离子水或蒸馏水，避免酸、乙醇、螯合剂、氧化消毒剂等物质混入。 （3）准确配制洗液，洗液中 Tween20浓度高于 0.2%，可使包被于固相上的抗原、抗体解吸附而影响实验测定下限。（ 4）标记物工作液要在使用前配制，容器洁净，充分混匀，避免水分挥发和污染（避免标记物的挥发造成实验室污染 , 导致本底过高）。4）.加样准确吸取 25l的 hAFP或 F -hCG标准

44、品标准品（ Std ）、待测样本 (Unk) ，依次加入微孔反应板微孔中。影响因素与建议：（ 1）建议每次实验必须做标准曲线， 待测样本作复孔检测。标准品复溶后2 8可以保存6 天；如长期保存请在20存放，并避免反复冻融。（ 2）试剂要混匀，不可剧烈颠倒。加样枪要定时校准，在万分之一天平上误差 <10%。加样枪按钮压至第一档垂直握持，使吸嘴浸入液体，浸入深度:20ul和 10ul 1mm,100ul 2-3mm， 200ul和 1000 ul 2-4mm， 5000ul 3-6mm，10000ul 5-7mm，避免枪头外残留过多，导致结果偏高。加样要准确一致，不可产生气泡、溅出，移液枪头要一次性使用，避免交叉污染，干吸头预先在血清中反复抽吸三次， 保证吸样量准确， 吸嘴要伸入反应孔底部1/4-1/3处加样，停靠5s，避免样本在反应孔上部滞留，导致非特异性吸附。使用连续加样枪，按常规速度和程序，重复吸加10 次，计算误差率50ulCV 1.5%， 100ulCV 1.0%，1000ulCV0.8%。定期进行定标，超标时予以更换。5）. 加铕标记物向每孔中加入 200l已配好的标记物工作液，并加贴封片。影响因素与建议： 一定要贴加封片， 防止液体挥发和污染