空肠弯曲菌肠炎基因调控硕士论文

1、空肠弯曲菌鞭毛输出系统关键基因flhA突变株的构建及其功能的初步研究摘要 3-4 Abstract 4 第一章 引言 8-14 1.1 空肠弯曲菌生物学特征及其致病性 8 1.2 空肠弯曲菌鞭毛的结构、合成及其调节 8-10 细菌鞭毛的组成结构 8 细菌鞭毛合成及其调节机制 8-9 空肠弯曲菌鞭毛输出系统 9-10 1.3 与空肠弯曲菌致病性相关的表型 10-11 鞭毛介导的运动性与菌体致病性 10 菌体自身凝集性与致病性 10-11 生物膜形成能力与菌体致病性 11 1.4 立题背景与意义 11-12 1.5 课题研究内容和研究目标 12-14 第二章 实验材料与方法 14-29 2.1 实

2、验材料 14-18 菌株、质粒及引物 14 培养基及用途 14 主要仪器 14 主要试剂 14-18 2.2 分子生物学基础实验操作 18-22 E.coli感受态细胞的制备 18 质粒的小量提取 18 基因组的提取 18-19 l PCR反应体系 19 SDS-PAGE凝胶电泳 19-20 质粒或PCR产物的酶切 20 酶切产物或PCR产物的纯化回收 20-21 单酶切后质粒的去磷酸化 21 质粒和PCR产物的连接 21 质粒转化入感受态细胞 21-22 菌种保藏 22 2.3 插入失活法构建C.jejuni ATCC33291 flhA突变株 22 敲除载体pMD19-T-flhA-kan

3、r的构建 22 flhA突变株的构建 22 2.4 HXW001毒力相关表型研究 22-23 测定生长曲线 22-23 透射电镜(TEM)观察菌体形态 23 运动能力实验 23 生物膜形成能力 23 自身凝集性 23 2.5 荧光定量PCR的方法研究flhA对鞭毛合成的调节功能 23-25 RNA的提取 24 DNA酶降解RNA中的DNA污染 24 cDNA的合成 24-25 荧光定量PCR体系 25 2.6 flhA对型毒力蛋白CiaB胞内转录和胞外分泌能力的研究 25-29 flhA对C.jejuni 型毒力蛋白CiaB胞内转录水平的影响 25 2.6.2 C.jejuni 型毒力蛋白Ci

4、aB的制备和浓缩 25 ciaB原核表达系统构建 25-26 CiaB蛋白的诱导表达 26 Ni-NTA树脂纯化CiaB蛋白 26-27 透析袋的预处理 27 纯化后蛋白质浓缩保存 27 NTA树脂的再生 27-29 第三章 结果与讨论 29-46 3.1 C.jejuni ATCC33291 flhA突变株的构建 29-31 敲除载体构建成功 29-30 3.1.2 C.jejuni ATCC33291 flhA突变株构建成功 30-31 阶段小结 31 3.2 HXW001毒力相关表型的研究 31-36 HXW001在液体环境中生长稳定 31-32 HXW001丧失运动能力 32-33 电

5、镜观察HXW001失去鞭毛 33 HXW001生物膜形成能力下降 33-34 HXW001自身凝集现象减弱 34-35 阶段小结 35-36 3.3 flhA对鞭毛合成调节功能的初步研究 36-40 荧光定量PCR原理 36-37 flhA对鞭毛合成相关基因的调控功能 37-40 阶段小结 40 3.4 flhA对型毒力蛋白CiaB胞内转录和胞外分泌能力的研究 40-46 flhA对ciaB胞内转录水平的影响 41-42 ciaB扩增结果 42 ciaB原核表达系统的构建结果 42-44 CiaB蛋白的表达结果 44-45 CiaB蛋白的纯化结果 45 阶段小结 45-46 第四章 结论与展望

6、 46-47 4.1 结论 46 4.2 展望 46-47 致谢【学科专业名称】 微生物学 【学位年度】 2010 【论文级别】 硕士 【关键词】 空肠弯曲菌; flhA; 鞭毛; 基因调节; 【英文关键词】 Campylobacter jejuni; flagellar; flhA; gene regulation; 【中文摘要】 空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)为微需氧、无芽孢的革兰氏阴性弯曲短杆菌,是全球范围内人类感染性腹泻常见的食源性病原菌。鞭毛不仅是其运动器官,更是主要的毒力因子,在C. jejuni黏附、定殖、侵入肠上皮细胞以及毒力蛋白分泌外输过程中起重要作用

7、。鞭毛输出系统是鞭毛合成、装配以及功能表现重要的结构基础,大部分研究认为鞭毛输出系统与革兰氏阴性细菌的型毒力蛋白分泌系统在进化上是同源的,基因组分析以及相关的实验研究初步显示,鞭毛输出系统很可能承担了C. jejuni型毒力蛋白的转运功能,与C. jejuni鞭毛致病性密切有关。 为了深入探索鞭毛输出系统与鞭毛合成以及致病性关联的分子机制,本课题运用分子生物学手段构建了C. jejuni鞭毛输出系统关键基因flhA突变株(HXW001),并初步研究了flhA在毒力和分子调控方面的功能。 1、flhA插入失活突变株HXW001的构建与鉴定 本研究使用插入失活的方法构建空肠弯曲菌flhA突变株,首

8、先在E.coil JM109中构建敲除载体pMD19-T-flhA-kanr。其次,使用电转化的方法将其导入到空肠弯曲菌中,利用同源重组获. 【英文摘要】 Campylobacter jejuni,a microaerophilic, asporous, Gram-negative bacterium, is the most frequently gastrointestinal food-borne pathogen worldwide.Flagellum can not only provid motility to the cell,but also is an important virulence factor,which plays an important role in adhesion, colonization, and the secretory of invasion protein of C. jejuni. Flagellar export apparatus is a