RNA干扰技术及其应用

1、RNA干扰技术及其应用柳满 生物制药1201 1202150124摘要：1998年AndrewFire和Craig CMello发现双链RNA可以抑制线虫同源基因的表达使基因沉默，并且沉默可遗传给后代。现将这类小干扰RNA分子可以高效、特异地阻断体内同源基因表达，促使同源mRNA降解，诱使细胞表现出基因缺陷的表型现象称为RNA干扰。本文从RNAi的发现、机制、生物学功能、应用来论述RNAi。转基因沉默现象最初在植物中被发现。RNAi的作用机制：dsRNA进入细胞内被Dicer酶切割成siRNA。siRNA的双链结构被解螺旋与沉默复合物形成复合物，siRNA双链被解开，然后特异性结合到靶RNA上

2、，切割RNA。mRNA剪切过程中新形成的21-23个siRNA又可以进入下一轮循环而达到扩增效应的目的。生物学功能：沉默、机体内源性基因表达。RNAi的应用：基因功能的研究、基因剔除、医学方面的应用、RNAi药物。关键词：基因沉默 RNAi siRNA miRNA 以前我只知道遗传物质有DNA、RNA，亦只知道RNA的功能是转录。但随着知识的增多，我了解到原来蛋白质也是一种遗传物质，例如Prion蛋白。Prion学说的出现使得蛋白质不仅体现生物学功能，而且可储存遗传信息。 PrPC蛋白高级结构的改变不仅可造成蛋白功能的变化，在某种意义上还是遗传信息传递的方式。我亦知道了不是所有的RNA都是单链

3、的，更知道了RNA的功能不仅仅只是转录。通过学习分子生物学检测技术，我知道了RNA干扰现象的发现、作用机制、应用等。1998年AndrewFire和Craig CMello发现双链RNA可以抑制线虫同源基因的表达使基因沉默，并且沉默可遗传给后代。现将这类小干扰RNA分子可以高效、特异地阻断体内同源基因表达，促使同源mRNA降解，诱使细胞表现出基因缺陷的表型现象称为RNA干扰。2006年10月2日，瑞典皇家卡罗林斯卡(Karolinska)医学院宣布，将2006年度诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁·费里(AndrewFire)和克拉格·米洛(Craig CMell

4、o)，以表彰他们在1998年的重要发现。瑞典皇家卡罗林斯卡医学院在颁奖声明中宣称，费里和米洛的发现能解释许多令人困惑、相互矛盾的实验结果，并提示了控制遗传信息流动的自然机制。RNAi的很多领域还是未知的，这有待于我们一代一代人的不断努力，去揭开其神秘的面纱，为我们自己提供更好的医疗条件等。一.RNA的起源 秀丽新小杆线虫中的RNAi途径 转基因沉默现象最初在植物中被发现。研究人员在植物中导人额外的产生特定色素的基因，试图创造一种深色的花朵，结果发现，所有导入的额外基因连同内源性基因都被沉默(Napoli et a1，1990；Van der Krol et a1，1990)。线虫中的转基因通常

5、能在成体组织中表达，而在幼虫中表现沉默(Kelly and Fire，1997)。共抑制，即沉默和转入片段序列相同的内源基因，这一现象也在线虫的幼虫中被观察到(Ketting and Plasterk，2000；Dernburg et a1，2000)。在秀丽新小杆线虫的每个细胞中导人几个小分子dsRNA(Fire et a1，1998)就能产生显著的反应。这一结果表明在整个生物体中存在着一条应答基因沉默的调控通路。Mello实验室检测得到两类RNAi缺陷型(rde)突变体(Tabara eta11999)。第一类由rde-1和rde一4组成，仅涉及RNAi途径，不参与其他过程。第二类突变体包

6、括rde-2、rde-3和mut一7，它们仅参与幼体的RNAi过程。这类突变体也具有一个增变突变体的特征，即雄性线虫常表现为温度依赖的不育，而生殖细胞却呈现正常沉默的转位子的移动(Collins et a1，1987；Kettinget a1，1999)。Ketting等人于1999年证实多数增变突变体不发生基因沉默。秀丽新小杆线虫中RNAi的重要特征之一是具有可遗传性。将靶向调节母体中胚胎发育基因的dsRNA注入雌雄同体线虫内会导致母体中的胚胎死亡。然而，RNAi效应不会瞬间生效，大约12h后生物体发生变化，继而导致后代死亡。在注射后412h产生的后代也可能受到影响，因此，当它们成年后会产下

7、死亡的卵。这种生物体称为RNAi效应“携带者”。Kell和Fire证明导入线虫的DNA序列的可遗传特征是由于有效的基因沉默，同时他们也证实只要转基因与基因组DNA混合后一起注入就能获得表达线虫幼虫转基因的转基因动物。其他研究组报道利用粒子轰击而不是传统的注射方法所得到的转基因动物能够持续表达单拷贝的转基因(Praitis et a1，2001)。二.RNAi的作用机制1.起始阶段 在起始阶段，外源的dsRNA通过导入或者转基因、病毒感染、转座子活化及特异重复序列及特异重复序列或其他未知方式进入细胞。引入的dsRNA被核酸酶RNnase III家族中特异识别，后者以一种ATP依赖的方式

8、逐步将dsRNA切割成长21-23个核苷酸的有正反义链组成的双链小分子干扰RNA，且每条单链的3'd都带有2个突出的非配对碱基（多数是UU）。siRNA是识别靶RNA的标志，它的生成启动RNAi反应。2.效应阶段 siRNAs的双链结构需被解螺旋后组装到RNA诱导的沉默复合物中，形成一复合物，此复合物由内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA搜索活性蛋白4种蛋白成分组成。在ATP存在下，该复合物中解旋酶活性将siRNA双链解开，并定位到siRNA的反义链互补的靶RNA转录本上，在距离siRNA双链3'端12个碱基的位置切割mRNA.3.倍增阶段 以往许多实验发现仅需少量siR

9、NA即可引起强烈的同源基因表达抑制，研究者推测在mRNA剪切过程中产生的21-23个核苷酸片段可能会作为新的siRNA而继续参与RNAi过程，从而使干扰作用放大，存在倍增放大机制。我对于机制简单的理解既：dsRNA进入细胞内被Dicer酶切割成siRNA。siRNA的双链结构被解螺旋与沉默复合物形成复合物，siRNA双链被解开，然后特异性结合到靶RNA上，切割RNA。mRNA剪切过程中新形成的21-23个siRNA又可以进入下一轮循环而达到扩增效应的目的。关于扩增反应：最近，至少在一些研究中发现扩增反应的存在。次级siRNA可能通过称为过渡性RNAi(transitiveRNAi)的机制产生。

10、其过程可能是siRNA或短的反义RNA可发挥启动特异性依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRP)合成与被靶定序列互补的RNA(cRNA)共同重新合成产生dsRNA的作用，然后通过DCR裂解成新的siRNA。也有新的证据表明有些RdRP也能非常高水平地进行特异性转录或在检测到如病毒入侵的异常RNA存在的情况下不需要启动子就能产生cRNA。最早提出的这种设想是用来解释植物转基因产生的PTGS现象。推测对细胞带来的优势是更多的mRNA引发并导致更多的靶基因失活，使得细胞更有效地清除感染的病毒。三.RNAi生物学功能RNA沉默突变体的筛选最早是在放线菌中进行的，最近在线虫和果蝇中也有所发展，并导致确定了几

11、种RNAi应答相应蛋白质必需的基因，包括DCR、RdRP、RISC及各种解旋酶等。沉默包含的连续遗传学途径分析阐明了这些不同功能成分发挥作用的前后顺序及一些新的功能。有些RNAi相关基因缺失突变表现出一些表型，包括增强了对病毒感染的敏感性，增加了倒C跃，因子的移动，发育时序的缺失，有丝分裂和减数分裂的缺失，不育和其他一些发育过程的缺陷。这些表型对进一步增强对RNAi功能的理解具有重大意义。最激动人心的发现之一是RNAi调控有机体内源性基因的表达。这种内源性RNAi作用是由机体基因组编码的一类小的调控性RNA(microRNA，miRNA)所介导的。这种miRNA多数情况下与靶mRNA的3个非翻

12、译区(3，untranslatedregion，3'UTR)完全互补结合，有些miRNA功能上类似siRNA，整合入RISC并导致靶mRNA裂解。不过，许多miRNA可能通过其他替代途径发挥作用，它与靶序列并不完全互补结合，因而不影响靶mRNA稳定性，而是通过干扰翻译过程而阻止编码蛋白质的合成。最近发现，这种干扰性RNA与靶mRNA的错配及甲基化的部位至关重要，miRNA在与靶位杂交过程中，其与靶序列的错配发生在结合区中间部位从而形成“U”形区域，影响其靶基因的翻译过程。假如siRNA分子能有效地结合其靶序列(序列配对及其空间结构决定)，那么siRNA分子还可以导致靶RNA分子的切割。

13、已有证据表明单一结合位点也可介导翻译过程的抑制或下调。然而，let-7miRNA的内源性靶分子的YUTR含有多个与其结合的位点，这提示有些情况下，单一结合的情况可能不足以抑制靶基因的表达。miRNA与siRNA的区别相同点：1.二者的长度都约在22nt左右。2.二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点。3.二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在。4.都与RISC形成复合物起干扰、调节作用。5.都可在转录后，翻译水平上干扰靶mRNA。不同点：1.根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA

14、干涉的中间产物。2.结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。3.在作用方式上，miRNA可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。4.miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而siRNA是抑制转座子活性和病毒感染。 四.RNAi的应用1.基因功能的研究 人类基因组测序完成，预测有30000-40000个编码蛋白的基因，需要大规模高通量的研究手段。RNAi能高效地特异地阻断基因的表达，因而RNAi已成为研究基因功能的工具。例如：通过遗传学和分子生物学分析，现已知在植物中RNA

15、介导的基因沉默有三种途径：细胞浆siRNA介导的基因沉默、通过miRNA的内源性的信使RNA沉默、与DNA的甲基化后抑制转录有关。在染色质水平RNA介导的沉默的一个重要作用可能是保护基因组免受由转座子引起的损害。2.基因剔除 为了解某个单个基因功能，常常人为地剔除无关的或不需要的基因。但基因剔除技术操作技术复杂，而且1次只能一个基因，有时还可能导致个体的早期死亡。RNAi技术具有高效、特异、操作相对简便。效果稳定的优势，并且一次课研究多个多个基因。 RNAi已经被暗示参与了被称为“基因沉默的根本形式”多余的DNA的程序性切除(theprogrammedexcisionofDNA)so)。这种现

16、象已经在具有纤毛的原生动物中发现，这些生物在进行性接合的过程中，其基因组进行广泛的重组。3.基因治疗 RNAi已作为一种新基因治疗法，被广泛应用于病毒感染、癌症等研究中。4.医学方面的应用 关于RNAi在医学中的应用，仍有很多问题有待解决。针对特定疾病治疗的基因疗法的应用比最初的预期要缓慢得多。当然，存在许多潜在的基因靶位可以利用RNAi进行治疗性干扰。现在已开始了在体内利用RNAi拮抗疾病进展的研究。例如，RNAi敲除Fas基因或丙肝病毒基因组以保护小鼠免于肝炎的侵害。目前，这方面的研究还主要致力于预临床前的阶段。RNAi药物 RNAi药物有望治疗癌症，丙肝和艾滋病等病毒性疾病，甚至可能用来

17、治疗神经系统疾病。第一个RNAi药物bevasiranib(Acuity公司)已经诞生，用于治疗湿性老年性黄斑变性(AMD)。美国Alnylam公司开发的RNAi药物用来治疗呼吸道合胞病毒感染、流行性感冒、帕金森病和高胆固醇血症等，其中治疗呼吸道合胞病毒感染的RNAi药物ALNRSV01已进人I期临床；默克公司研制的治疗老年性黄斑变性的RNAi药物Sirna一027已经进入期临床；另外，PTC Therapeutics公司开发的用来治疗实体瘤的以VEGF为靶点的siRNA药物PTC一299也已经进入I期临床。我的感悟：尽管RNA不是主要的遗传的物质，但仍有其不可替代的作用：如转录。说明任何事物

18、的存在都是有道理的，没有什么会凭空存在或凭空消失，很多时候我们不要妄自菲薄；小干扰RNA在19981才被发现，尽管被发现的很晚，但其的作用是一直存在的，自从被发现后，引起了很多人的关注，这说明只要我们有才，终究会被发现，只是时间的问题，而在被埋藏的那些日子里，我们需要做的是不断沉淀自己，充实自己。在今后的学习中，我会多关注RNAi的进展和其成功。或许将来有天，我亦会去研究其中的一个应用，但前提是我得从现在开始积累相关知识，为以后做准备。参考文献：1. Prion一种无核酸的微小生命体?董小平 中国预防医学科学院病毒学研所2. RNA干扰技术：从基础科学到药物开发（美）K.阿帕萨尼主编 殷勤伟等译,3. 双链RNA引起的基因沉默机制2006年诺贝尔生理学或医学奖成果简介.Baulcombe DC, Voinnet O. Slcombe 4. RNA干扰技术的研究进展 徐俊、毛颖、苗荻、郝佳 中国知识产权专利局专利审查协作北京