产品临床试验工作问题小结刘远泽

1、产品临床试验工作问题小结产品临床试验工作可分为五方面：1、工作前的计划与准备：试验方案拟定与试验用品的准备； 2、试验样本准备：人全血基因组DNA提取及信息整理； 3、试验样本检测：RT-PCR检测及结果分析； 4、工作流程中问题的发现、交流与解决；5、收尾与总结。针对此次苏大附一院临床试验工作流程中出现的诸多问题，做如下总结与思考：1、工作前的计划与准备 - 种类与数量试验用品的准备：1、试剂盒：基因型检测试剂盒：反应液/反应酶/质控品血液基因组DNA提取试剂盒2、耗材：移液器（枪）：1000 ul / 200 ul / 50 ul / 10 ul / 2 ul（白色长尖）吸头（枪尖）：20

2、 ul （白色长尖）/ 200 ul （黄色）/ 1000 ul （蓝色）吸头盒（三种规格）荧光PCR管（长且不透明、8联排）和盖子Eppendrof 管（1.5 ml）多空板（96孔 / 60孔）、样本储存盒（72孔）、Marker 笔、手套3、样本信息对照表2、试验样本准备（人全血基因组DNA提取）- 节奏与程度提取前的检查与准备：1、检查试剂盒各溶液，若产生沉淀，须在室温放置一段时间，必要时可在37 水浴预热，溶解沉淀；2、依据提取步骤，为溶液编号；3、缓冲液GD和漂洗液PW 需加入适量无水乙醇；4、剪去吸附柱的盖子提取步骤：1、第二次加入细胞裂解液CL（裂解红细胞）时，需要剧烈振荡，以

3、充分混匀沉淀（可见管中液体深红，并有较多泡沫，管底无结块沉淀）；2、加入缓冲液GB后，充分颠倒混匀（如不充分，可能会产生白色沉淀，一般37放置时会消失，不影响后续试验）；3、56水浴时间延长至30 40 min，其间颠倒混匀数次，观察溶液是否变得清亮，并为收集管编号（如未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少、纯度不加，直接影响荧光检测）；4、水浴后加入200 ul 无水乙醇，出现絮状沉淀，轻柔颠倒混匀（此时DNA析出，故自此步骤开始，颠倒要轻柔缓慢，否则破坏DNA结构）；5、最后向吸附膜中间位置悬空滴加100ul 超纯水。3、试验样本检测：RT-PCR检测及结果分析 - 精细、顺

4、序、安全RT-PCR前的准备：1、超净工作台紫外光灭菌；2、从-20取出扩增反应所需的反应液和质控品，置于室温溶解，涡旋混匀约10s，离心待用（可使试剂充分溶解混匀，避免因体系溶质不均匀影响反应）；3、准备荧光PCR八联排管（白色/长管长管与ABI 7500仪器符合度较好，利于充分受热，否则严重影响检测结果，导致荧光信号低），并适当标记；RT-PCR 反应体系的分装与加样：1、移液器的“连续吸放液” 调移液器量程至23ul ，将排放按钮按至第一停点（第一档），再将吸头垂直浸入液面，平稳松开按钮，在液面之下，再次将排放按钮按至第一档，排出吸头尖端的气泡后，松开按钮，吸入液体，之后放液只需按至第一

5、档即是23ul（如吸头尖端仍有气泡，可反复吸放，直至排净气泡）；2、样本放置顺序、吸头安装顺序、试验者感知顺序三者形成“校正机制”，保障顺序加样（校正机制的建立，有助于连贯而正确地加样）；3、移液器的吸放液要“慢吸快放”，且试验者要观察吸头尖端，进行视觉“校正”，避免吸空放空；4、放液时，吸头先伸入液面以下放出液体，再在管壁处打净残液（如吸头仍存残液，将移液器按至第二档，将残液打至吸头尖端处，拔掉吸头，并再次安装回去，将残液打回管中）；5、不能直接用手触摸PCR管，因为人的手上含有荧光素，沾染在管壁上的荧光素会影响荧光仪检测。操作时必须戴不含荧光物质的一次性手套并且要经常更换（应使用镊子夹取管

6、子和管盖）；6、吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；7、加样完成后，盖紧盖子，并离心；8、超净工作台使用后，用次氯酸钠擦拭，避免试验环境污染；结果分析：分析的思路：1、基线和阈值的选择和设置是否正确（直接与Ct值相关）；2、阳性和空白对照的结果是否正常（既可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性，空白对照的污染将导致结果失信。如空白对照出现阳性，则为污染，需检查试剂准备区域是否污染、检查使用的器材是否污染、检查实验室的区域分离和人流物流的单向流动等）；3、扩增曲线的线形关系如何（“S”型扩增曲线，分为四个阶段：基线期、指数增长期、指数扩增期、平台期）；分析中遇到的问题

7、：Q1：扩增曲线不正常，刚进入指数期就很快进入平台期并向右下弯曲；1.基线等设置不当：按仪器说明书重新操作；2.模板量过多：当扩增曲线在10个循环内起峰时，应将模板稀释后使用。Q2：Ct值出现过晚；1.反应条件不佳：未最佳反应条件，可重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等；2.PCR各种反应成分的降解或加样量不够；3.扩增产物片段过长：一般采用 100200bp 的扩增长度。Q3：无Ct值（信号）出现；1.反应循环数不够：一般都要在 35 个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号；2.检测荧光信号的步骤有误：一般采用延伸时采集荧光，Taqman 方法则一般在退火结束或延伸结束采集信号；3.引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；4.探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已延伸；5.模板量少：提高样品提取的浓度；6.模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生。Q4：空白对照也出现明显的起飞；1.荧光 PCR mix 或水被污染；2.引物二聚体的出现：在 35 循环后出现扩增属正常情况，可配合溶解曲线进行分析；3.反应过程中探针降解：用PAGE电泳对探针进行检测。Q5：扩增效率低；1.反应试剂中部分成分降解；2