特异性阻断SHH信号通路对外周血T细胞杀伤宫颈癌细胞功能影响

1、 论文评阅结果： 论文评阅人： 南方医科大学成人高等教育专升本毕业论文论文题目：特异性阻断SHH信号通路对外周血T细胞杀伤宫颈癌细胞功能的影响姓 名：年级专业班：学 号：论文提交时间：目录摘要.1关键词.1 第一章 研究背景.21.1实验材料及设备.3第二章 研究方法及步骤2.1 Hela细胞的培养.42.2 RT-PCR检测Hela细胞SHH信号关键分子的表达.52.3 分离外周血单个核细胞（PBMC）62.4 流式细胞技术检测T细胞活化相关CD分子.62.5 ELISA检测T细胞功能性细胞因子IL-10和IFN-释放水平7第三章 研究结果3.1 RT-PCR检测Hela细胞SHH信号关键分

2、子的表达.83.2 PBMC对Hela细胞杀伤作用的形态学观察.83.3 流式细胞术检测T细胞活化相关CD分子.93.4 ELISA检测T细胞功能性细胞因子IL-10和IFN-释放水平9第四章讨论9第五章结论.11参考文献.11摘 要目的：研究Sonic Hedgehog分子及其活化信号对外周血T细胞杀伤宫颈癌细胞功能的影响。方法：RT-PCR检测Hela细胞SHH信号水平。在Hela与PBMC共培养体系中添加SHH抗体来阻断SHH信号，形态学观察T细胞对Hela细胞的杀伤，流式细胞术检测T细胞活化，ELISA检测T细胞功能性细胞因子IFN-和IL-10释放水平。结果： SHH抗体可以促进T细

3、胞分泌功能性细胞因子IFN-，但抑制免疫抑制性细胞因子IL-10的分泌，增强T细胞杀伤宫颈癌细胞的效果。结论：特异性阻断SHH信号通路可以增强T细胞对宫颈癌细胞的杀伤作用。【关键词】：SHH； 宫颈癌； T细胞AbstractObjective: To study the Sonic Hedgehog signaling molecule and activation of T cells in peripheral blood of anti-cancer cell function. Methods: RT-PCR detection of Hela cells in SHH signal

4、 levels. PBMC were cultured in the Hela system with added SHH SHH antibody to block the signal, T cells morphology of anti-Hela cells, T cell activation by flow cytometry, ELISA detection of functional T cell cytokine IFN- and IL -10 release level. Results: SHH antibodies can promote T cell secretio

5、n of cytokines IFN-, but the suppression of the immune suppressive cytokine IL-10 secretion, enhanced T cell killing effects of cervical cancer cells. Conclusion: The specific blocking SHH signaling pathway can enhance T cell killing effect on cervical cancer cells.Keywords Sonic Hedgehog， cervical

6、cancer， T cell 研究背景肿瘤是一种常见的疾病，是机体在各种致瘤因素作用下，细胞异常增生而形成的新生物，肿瘤细胞具有异常的形态,代谢和功能。由于它的快速而无规律生长，不但消耗人体大量营养，而且破坏了正常器官的组织结构和功能目前肿瘤已经成为一列严重威害人类身体健康的常见病和多发病，现在全世界每年死于癌症的约有500万人。随着免疫学的发展和人们生活水平的提高，肿瘤越来越受到人们的重视，近来关于Hh信号通路与肿瘤发生的关系也引起注意，研究发现多种肿瘤中存在着Shh信号通路的异常激活，而宫颈癌细胞就是其中之一。子宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一。在全球范围内，每年约有20多万女性死于宫颈癌

7、。全球发病率最高的是南非，其次在亚洲，我国发病率每年新增发病数超过13万，占女性生殖系统恶性肿瘤发病率的7393，排行榜首。在发达国家，其发生率明显下降，在很大程度上归因于对宫颈癌前病变的早期诊断和治疗。在发展中国家，由于宫颈筛查工作不完善，女性对宫颈疾病的忽视，致使我国宫颈癌的发生率是发达国家的6倍。Hedgehog(Hh)基因，因为最初是从突变的果蝇体内发现，果蝇胚胎腹侧面布满尖状突起形似刺猬因而将其命名为Hedgehogt 1。1993年Forbes2等通过果蝇基因分析，首先提出Hedgehog信号通路(Hedgehog signalling，Hh信号通路)的概念，以后Chen等3较为系

8、统地阐述了Hh信号通路的基本组成及转导过程。在脊椎动物中，Hedgehog基因家族共包括三个成员：Indian hedgehog(Ihh)， Desert hedgehog(Dhh)和Sonic hedgehog(Shh)，其中关于Shh基因的研究最多。因此Sonichedgehog信号通路(简称Shh信号通路)的研究也相对更为深入。Shh信号通路对靶细胞的作用是通过细胞膜上Patched (PTC)和Smoothened(SMO)两个转录元件所介导。PTC是一种12跨膜蛋白，可和SHH蛋白结合。SMO是7跨膜蛋白为信号转导子。当SHH蛋白和PTC蛋白结合时，则PTC对SMO抑制解除，通过胞质

9、微管上附着的Hedgehog信号复合物(Hedgehog signaling complex，HSC)介导，使一种转录因子进入胞核，从而激活其下游基因的表达，该转录因子在脊椎动物中称为GLI，即在果蝇中被称为的ci。当SHH尚未与PTC结合时，PTC可以抑制SMO，使之转变成同一基因的转录抑制子，抑制其下游基因的表达。GLI共有3型即GLI1、GLI2和GLI3，每一种都有独特的转录功能，引起不同下游靶基因的激活或抑制。对果蝇的研究表明不同浓度的Hh基因表达的分泌蛋白HH可以引起靶细胞中不同形式的Ci进入其细胞核，从而引起不同的下游基因的表达4 。脊椎动物的研究也表明，Shh信号通路对靶细胞命

10、运的决定同样与SHH蛋白表达的强度密切相关即不同浓度SHH表达可以引起其邻近靶细胞产生不同形式的GLI进入胞核，进而引起不同基因的表达5，参与维持肿瘤细胞的多种恶性生物学行为。虽然机体的免疫系统能够产生肿瘤免疫应答，但是大多数肿瘤仍然能在体内进行生长，肿瘤细胞能通过自身的机制抑制免疫应答对自身的杀伤。随着Sonic Hedgehog信号通路的异常激活在越来越多的肿瘤中发现，人们对这个信号通路产生了浓厚的兴趣。现在人们不但发现SHH信号通路可以促进肿瘤细胞的增殖，而且人们还发现SHH信号通路也可以抑制T细胞的活化以及活化后的增殖，在已有国外实验发现了SHH分子及其活化信号在参与抑制T细胞活化和发

11、育方面具有一定的作用，这可能是肿瘤自我保护，逃逸体内免疫应答的重要机制之一。本研究通过阻断SHH信号后研究T细胞的活化及功能，探讨SHH信号对T细胞杀伤宫颈癌细胞株Hela的影响，为子宫癌防治提供新的思路，有助于提高子宫颈癌治疗的效果，并推动肿瘤免疫的理论发展。1.1实验材料及设备：1.1.1 细胞1.1.1.1肿瘤细胞1.1.1.2 PBMC细胞1.1.2 主要化学试剂：胰蛋白酶粉末 广州威佳科技有限公司RPMI-1640干粉（10.4g/包） Sigma公司碳酸氢钠 广州化学试剂厂 胎牛血清 杭州四季青生物工程公司氯化钠 台山化工厂氯化钾 广州化学试剂厂 磷酸氢二钠 广东汕头达濠精细化学品

12、公司磷酸二氢钾 汕头市化学试剂厂SHH抗体 Santa CruzELISA试剂盒 达科为生物技术有限公司1.1.3 主要仪器设备：单人双面净化工作台 SW-CJ-1F型 苏州净化单人双面净化工作台离心机 上海安亭科学仪器厂 TDL-5 Max:5000rpm4冰箱 Haier公司 BCD-256KF超纯水仪 Pall Corporation公司Model：Cascada LSTanon-4100全自动数码凝胶图像分析系统 上海天能科技有限公司 202A-2型数显电热恒温干燥箱 上海浦东荣丰科学仪器有限公司SCIENTZ SB5200D 超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司二氧化碳细胞培养

13、箱 Heraeus公司 HERA cell 150 手提式压力蒸汽灭菌器YX-280 合肥华泰医疗设备有限公司流式细胞仪 美国Beckman Coulter公司 倒置荧光显微镜 奥林巴斯BP110S电子天平 Sartorius公司 Max:110g d0.1gJYT-2架盘药物天平 马头牌微量移液器 Pipetman Gilson公司2 研究方法及步骤2.1 Hela细胞的培养2.1.1 细胞培养用具的准备 1）浸泡：将细胞培养瓶、移液管、10、50ml离心管、试剂瓶、血清瓶、安培瓶等实验用具用清水冲洗干净，浸泡于洗衣粉水中，浸泡过夜。 2）刷洗：用试管刷沾洗衣粉反复刷洗，反复冲洗干净后放入电

14、热恒温干燥箱中烘干。 3）浸酸：将烘干的器皿放入酸缸中浸泡过夜，玻璃用具浸泡于硫酸缸中（配方：重洛酸钾63g，浓硫酸1000ml，蒸馏水200ml），塑料用具浸泡于盐酸缸中（5盐酸）。 4）冲洗：用具浸酸后用清水冲洗15次以上，再用单蒸水冲洗3次，再用双蒸水冲洗3次，必要时放入超声波清洗机中清洗，再放入电热恒温干燥箱中烘干。 5）高压：将烘干的实验用具用锡纸包好，再用报纸包好，大、中、小枪头直接用枪头盒装好用报纸包好，置高温高压灭菌箱中高压灭菌，再放入电热恒温干燥箱中烘干。2.1.2 细胞复苏（Hela细胞） 从-120液氮罐中取出冻存的Hela细胞，迅速放到37水浴锅中，使细胞溶解，用酒精灯

15、轻烧冻存管口，打开管盖，用吸管吹散细胞后，吸出细胞悬液到离心管中，加入23ml1640培养液，混匀后离心1000rpm，10min；弃去上清液，加入5ml新鲜培养液（含10血清），并用吸管轻轻吹打悬浮细胞，将细胞悬液移到细胞培养瓶中，37培养。2.1.3 细胞传代 取生长良好的Hela细胞，在超净台中倒去旧培养液，加入2mlPBS，轻轻振荡漂洗细胞，以去除细胞碎片，弃去PBS，再加入胰酶溶液，37消化大约2min，在倒置显微镜下观察细胞情况，待细胞开始变圆球形时，立即停止消化，并弃去胰酶，加入2ml1640培养液，加入一滴血清，然后反复吹打细胞，使Hela细胞悬浮，再取1ml细胞悬液移到另外一

16、个干净的培养瓶里，最后每瓶细胞的培养基补到5ml（含10牛血清），做好标记，放进细胞培养箱里培养。2.1.4 细胞换液 取生长良好的Hela细胞，在超净台中倒去旧培养液，加入2mlPBS，轻轻振荡漂洗细胞，以去除细胞碎片, 弃去PBS,加入5ml（含10牛血清）的1640培养基，放进细胞培养箱里培养。2.1.5 细胞冻存 在超净台中倒去旧培养液，加入2mlPBS，轻轻振荡漂洗细胞，以去除细胞碎片, 弃去PBS，再加入胰酶溶液，37消化大约2min，在倒置显微镜下观察细胞情况，待细胞开始变圆球形时，立即停止消化，并弃去胰酶，加入2ml1640培养液，加入一滴血清，然后反复吹打细胞，让细胞从瓶壁上

17、吹打下来，使Hela细胞悬浮，再将细胞悬液转移到离心管中，1000rpm，10min，弃去上清液，加入1ml1640培养基，300ul血清，150ulDMSO，将细胞重悬，将悬液转移到冻存管，遵从“慢冻”原则，先在4保存2小时，再移到-20保存4小时，再移到-80保存24小时（过夜），最后移进液氮罐。2.2 RT-PCR检测Hela细胞SHH信号关键分子的表达2.2.1 提取Hela细胞的RNATrizol抽提步骤：1) 匀浆化作用通过离心来沉淀细胞后，弃上清，用移液管加TRIZOL试剂反复吹打来裂解细胞至均一通亮的液态后，将匀浆样品在1530°C 条件下孵育5 分钟以使核蛋白体完全

18、分解。2) 分离阶段每1 mlTRIZOL 加0.2 ml 氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管。在4°C 下12,000×g 的离心力高速冷冻离心15 分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA 无一例外地存在于水样层当中。3) RNA的沉淀将水样层转移到处理过的EP管中，通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。最初均化时的每1 mlTRIZOL 对应0.5 ml 异丙醇。在4°C 下12,000×g 的离心力高速冷冻离心15 分钟。RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。 4) RN

19、A的洗脱 移去上层悬液。用异丙醇洗涤RNA 沉淀一次，在4°C 下7,500×g 的离心力高速冷冻离心5 分钟。5) RNA的再溶解 在操作的最后，简单干燥RNA沉淀。尤为重要的是，不能让RNA沉淀完全干燥那 样会极大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA样品其A260/280 比值< 1.6。用移高压过的水20ul溶解RNA。 6) 等DNA电泳条带跑到将近电泳板中间即可上机扫描。2.2.2琼脂糖凝胶电泳 1) 称取0.3g琼脂糖，加入20ml 1×TAE缓冲液（小胶，浓度：1.5），混匀于三角瓶中，将三角瓶放入微波炉加热（注意瓶口盖住，防止凝胶因蒸发而减少）

20、。 2) 待凝胶溶液稍微冷却，加入1.2l EB，混匀后倒入事先用电泳缓冲液浸泡的电泳板中（梳子先插好）。 3) 等凝胶凝固后，水平垂直拔梳，将凝胶放入电泳槽中。 4) 将1l样品与1l 6×laoding Buffer与4lH20混匀，上样，Marker为2000bp。 5) 设置恒压100MV，开始电泳。2.3 分离外周血单个核细胞（PBMC） 将成分血与PBS按1：5的比例稀释，将稀释后的成分血沿着管壁缓慢加在占血液量1/2的淋巴细胞分离液上，形成明显分层，室温水平离心2000rpm，15min。此时离心管中自上而下形成4层，用滴管小心抽取由PBMC构成的云雾层（由上到下第二层

21、），转移到新的离心管，再离心1500rpm，1015min。去掉上清液，如发现有红细胞可以加入红细胞裂解液510ml，用滴管轻轻吹散，静置10min。再次离心1500rpm，10min。去掉上清液，加15mlPBS吹打，离心1500rpm，10min。去掉上清液后再加5mlPBS吹打，离心1500rpm，10min。最后弃上清液，加入2ml培养基，重悬细胞，再将细胞重悬液转入新的培养瓶，补加到5ml培养基（包括血清），加入2.5ul/mlIL-2。将其放入细胞培养箱培养。2.4 流式细胞术检测T细胞活化相关CD分子2.4.1 种板（6孔板）1) 取生长状况良好的两瓶Hela细胞，弃去原培养液，

22、各加入2mlPBS清洗细胞，再弃去PBS。2) 各加入1ml胰酶消化细胞2min，弃去胰酶。3) 各加入2ml培养基，用滴管将瓶壁的细胞吹打下来。4) 将两瓶培养瓶的细胞悬液转移到同一离心管中，吹打均匀。5) 另取一EP管，加入180ulPBS。6) 取20ul细胞悬液加入到上述EP管中，吹打均匀。在细胞计数板上进行细胞计数。7) 取上述细胞悬液加入6孔板中，然后每孔各补加血清10，培养基，吹打均匀，使每孔都为2ml，每孔有3×105个Hela细胞，将6孔板放入细胞培养箱培养。2.4.2 共培养1) 将六孔板分为3组，分18hr 24hr 48hr三个不同时间段检测：实验组：SHH高

23、表达子宫癌细胞（株）+外周血T细胞+SHH抗体；对照组：SHH高表达子宫癌细胞（株）+外周血T细胞2) 先取20ulPBMC细胞悬液加入装有180ulPBS得EP管中，吹打均匀。在细胞计数板上进行细胞计数。3) 将6孔板中的培养液用移液枪吸出。在3个孔中加入原PBMC悬液，血清10，培养基，使每孔都为2ml，每孔有3×106个PBMC细胞，而其他3个孔中更新新的血清10，培养基，将6孔板放入细胞培养箱里培养，其中在实验组里面每孔加入SHH抗体10ul，使孔中SHH抗体终浓度是1g/mL。2.4.3 流式细胞术检测1) 取12个EP管，与6孔板上的孔一一对应，编上号。2) 用移液枪将6

24、孔板内的液体吹打均匀，注意要把所有细胞都基本吹打下来，然后转移到相应的EP管中，离心3000rpm×3min，弃掉上清液。3) 用1mlPBS洗涤细胞一次，离心3000rpm×3min，弃掉上清液。4) 每支EP管各加入60ul的PBS，吹打均匀。5) 与18hr时间段的孔对应的EP管每管都加入10ulCD3单抗和10ulCD69单抗进行标记。6) 与24hr 48hr时间段的孔对应的EP管每管都加入10ulCD3单抗和10ulCD45RO单抗进行标记。7) 另取4个EP管分别加入1mlPBMC细胞悬液，离心3000rpm×3min，弃去上清液，再用1mlPBS洗

25、涤细胞一次，分别编号空白，CD3单抗,CD69单抗，CD45RO单抗。再分别用对应的CD分子标记。8) 将所有EP管用锡纸包好后，避光作用25min。9) 另准备16支流式管，与EP管一一对应编上号，再用锡纸包好后置于试管架上。10) 染色结束后，用移液枪将EP管中的液体全部转移到相应的流式管中。11) 每支流式管各加入2ml流式洗涤液，离心1000rpm×10min。12) 弃掉上清液，加入500ul85的多聚甲醛打散细胞13) 上机检测2.5 ELISA检测T细胞功能性细胞因子IL-10和IFN-释放水平2.5.1 种板（96孔板）1) 取生长状况良好的两瓶Hela细胞，弃去原培

26、养液，各加入2mlPBS清洗细胞，弃去PBS。2) 各加入1ml胰酶消化细胞2min，弃去胰酶。3) 各加入2ml培养基，用滴管将瓶壁的细胞吹打下来。4) 将两瓶培养瓶的细胞悬液转移到同一离心管中，吹打均匀。5) 另取一EP管，加入180ulPBS。6) 取20ul细胞悬液加入到上述EP管中，吹打均匀。在细胞计数板上进行细胞计数。7) 取上述细胞悬液，补加血清10，培养基，吹打均匀，使每孔都为200ul，每孔有6×104个PBMC细胞,将新配好的细胞悬液加入96孔板，再将96孔板放入细胞培养箱培养。2.5.2 共培养1) 将96孔板分为5组，分别为：实验组：SHH高表达子宫癌细胞（株

27、）+外周血T细胞+SHH抗体对照组：SHH高表达子宫癌细胞（株）+外周血T细胞SHH高表达子宫癌细胞（株）外周血T细胞培养基+10%血清2) 先取20ulPBMC细胞悬液加入装有180ulPBS得EP管中，吹打均匀。在细胞计数板上进行细胞计数。然后用培养基，血清与原PBMC细胞悬液配到每个孔为6×104个PBMC，每孔为为200ul的体积。3) 在之前种肿瘤细胞的96孔板，用移液枪将培养基吸出。在其中实验组加入新配好的PBMC悬液，而其他对照组更换新的培养基和血清，将其放入细胞培养箱里培养。其中在实验组里面加入SHH抗体1ul，使孔中SHH抗体终浓度是1g/mL。2.5.3 ELIS

28、A检测1) 使用前，将所有试剂充分混匀，避免产生泡沫。2) 收集96孔板孔里的细胞上清液，100ul/well加入标准样品孔里。3) 加检测抗体：50ul/well加入稀释的Biotinylated antibody混匀后盖上封板膜，室温（1825 C）孵育2hr。4) 洗板：扣去孔内液体，290ul/well加入1×washing buffer；停留1min后弃去孔内液体，重复3次，最后一次在滤纸上扣干。5) 加酶：100ul/well加入StreptavidinHRP。盖上封板膜。室温孵育20min6) 洗板：扣去孔内液体，290ul/well加入1×washing b

29、uffer；停留1min后弃去孔内液体，重复3次，最后一次在滤纸上扣干。7) 显色：100ul/well加入TMB。室温避光孵育1015min。8) 终止反应:迅速100ul/well加入Stop Solution终止反应。9) 读板：终止后10分钟内，用酶表仪检测，检测波长为450nm。3 研究结果3.1 RT-PCR检测Hela细胞SHH信号关键分子的表达图1.Hela细胞SHH关键分子表达Fig1. Hela cell expression of key molecules SHHM：Marker(DL2000); 1: GAPDH(657bp); 2: GLI-1(185bp)；3:G

30、LI-2(322bp); 4：Fas(320bp)；表1 Hela细胞SHHSHH关键分子表达水平基因 光密度比GLI-1/ GAPDH 0.708229GLI-2/ GAPDH 0.458853FAS/ GAPDH 0.564422由图1我们可以知道Hela细胞表达SHH关键分子GLI-1,GLI-2基因，推测HELA细胞SHH信号通路是处于激活状态的。3.2 PBMC对Hela细胞杀伤作用的形态学观察倒置显微镜下观察T细胞杀伤肿瘤细胞情况，结果显示：Hela细胞和PBMC共培养24hr，没加SHH抗体的共培养体系中Hela细胞的生长状况良好，而加了SHH抗体的共培养体系中Hela细胞生长较

31、差，部分Hela细胞形态有变圆趋势，细胞通透性较差；共培养48hr，没加SHH抗体的共培养体系中Hela细胞生长状况已经出现死亡，而加了SHH抗体的共培养体系中Hela细胞死亡更严重，外周血T细胞数量也明显较多；共培养72hr，没加SHH抗体的共培养体系中仍有形态较好的Hela细胞，而加了SHH抗体的共培养体系中基本已经没有形态较好的Hela细胞了，细胞膜已经不完整，死亡细胞与细胞碎片聚集成团，并呈漂浮状。 3.3 流式细胞术检测T细胞活化相关CD分子本研究还采用流式细胞术检测CD3CD69双阳性细胞以了解T细胞活化情况。但结果显示，加SHH抗体的实验组与对照组T细胞活化分子表达无差异。我们推

32、测可能是由于T细胞对不同肿瘤细胞的反应存在差异，而我们尚未摸索出适当的的CD分子检测时间点造成的。3.4 ELISA检测T细胞功能性细胞因子IFN-和IL-10释放水平ELISA检测T细胞分泌细胞功能因子IFN-，结果发现单独培养的PBMC由于没有受到抗原的刺激，T细胞没有活化，所以IFN-的表达水平较低；在肿瘤细胞的刺激下，T细胞开始活化和增殖，介导抗肿瘤的细胞免疫，IFN-的表达水平增加；而SHH阻断抗体作用后可以促进T细胞分泌IFN-。培养24 hr、48hr、72hr，实验组（加入SHH阻断抗体组）与对照组（未加入SHH阻断抗体组）IFN-分泌水平经统计学分析均存在差异（P<0.

33、05）。4 讨论 本实验通过子宫癌细胞与PBMC细胞共培养的对照组和子宫癌细胞与PBMC细胞共培养加入SHH抗体的实验组，利用流式细胞术和ELISA检测T细胞活化相关的CD分子和T细胞功能性细胞因子IL-10和IFN-释放水平，从而来研究SHH信号通路对外周血T细胞杀伤子宫癌细胞的影响。 首先，通过提取Hela细胞的RNA，进行RTPCR发现Hela细胞表达GLI-1，GLI-2基因，由于实验条件的限制我们不能直接测定SHH蛋白表达，所以利用检测HELA细胞SHH信号通路关键分子GLI-1，GLI-2基因的表达，可以证明Hela细胞是有表达SHH信号通路。在实验中，通过倒置荧光显微镜的图片观察

34、到PBMC细胞杀伤宫颈癌细胞的情况，发现加入SHH抗体的实验组的杀伤作用在三个时间点都明显大于比未加入SHH抗体的对照组。推测SHH信号通路通过末端转录因子GLI-1促进下游靶基因的转录，靶基因的表达，产生一系列抑制免疫细胞杀伤自身的反应。通过ELISA检测T细胞功能性细胞因子IL-10和IFN-释放水平时，发现实验组三个时间点IFN-释放量也明显高于对照组，而且随着时间的增加分泌量也持续增加。IFN-具有一系列的生物学功能：抗病毒；抑制肿瘤细胞生长；促进B细胞产生抗体，IFN-活化巨噬细胞；增强NK细胞的细胞毒作用；刺激T细胞的细胞毒作用。可以说明SHH抗体发挥作用，阻断Hela细胞的SHH

35、信号通路，从而解除了Hela细胞中SHH信号通路对外周血T细胞的免疫抑制作用，使外周血T细胞IFN-分泌量升高，增强了T细胞杀伤Hela细胞的作用。而IL10的释放水平与IFN-释放水平正好相反，发现实验组三个时间点IL-10释放量也明显低于对照组，IL-10最初被称为细胞因子合成抑制因子,为含178个氨基酸残基的单肽链糖蛋白(其中N端18个氨基酸信号肽序列).分子量35-40 kDa,通常为二聚体,是具有多向性生物学活性的强免疫抑制因子，用来调节机体免疫异常，调控机体免疫反应的。推测可能是实验组中加入的SHH抗体发挥作用，阻断Hela细胞的SHH信号通路，从而解除了Hela细胞中SHH信号通

36、路对外周血T细胞的免疫抑制作用，使外周血T淋巴细胞的IL-10分泌量降低，减少了IL-10对T细胞的免疫抑制作用，增强了T细胞对Hela细胞的杀伤作用。可以推测SHH信号通路通过末端转录因子GLI-1促进下游靶基因的转录，靶基因的表达，作用于T细胞使其分泌IL-10，抑制T细胞的免疫反应，从而起到一个肿瘤自我保护，逃逸体内免疫应答的作用。 Hedgehog(Hh)信号通路是经典的胚胎发育和分化信号系统,哺乳动物有3种Hh糖蛋白,分别是Sonic hedgehog、Indian hedgehog和Desert hedgehog,跨膜蛋白Ptch和Smo组成受体复合物与Hh结合后,Smo构象发生改

37、变,解除了Ptch对其的抑制,Smo进入胞质,将信号下传,激活转录因子Gli(Gli1、Gli2、Gli3),后者进入细胞核,直接启动Ptch、Gli1、WNT、EGF、Cyclins等目的基因的表达,Hh信号通过Gli不仅调控细胞的生长、增殖与分化,也参与了肿瘤细胞的增殖和扩散17。通过这次实验，我们可以知道，SHH信号通路除了维持肿瘤细胞的多种恶性生物学行为，还可以通过自身的机制抑制免疫应答对自身的杀伤，抑制T细胞的活化以及活化后的增殖，这可能是肿瘤自我保护，逃逸体内免疫应答的重要机制之一。本研究探讨的SHH分子及其活化信号在免疫抑制中具有特殊作用，对该分子在子宫癌发病机制中作用的探讨将有

38、望为子宫癌防治寻找到一个新的作用靶点。以SHH分子及其活化信号为靶点将有望提高子宫癌防治措施的效果。大量研究证实了多种肿瘤细胞存在SHH分子的高表达及其信号的异常活化。所以SHH信号通路对外周血T细胞杀伤子宫癌细胞功能的影响这项研究就具有普遍代表性，对该机制的研究可以揭示多种肿瘤发病的机制，有望为肿瘤防治提供新靶点。提RNA时应注意用力地、均匀地吹打Trizol，使细胞充分裂解，RNA能够释放到Tizol中，避免被空气中的RNA酶降解。加入氯仿后要用力充分混匀，彻底除蛋白。但加入异丙醇之后则注意不要太用力振荡，避免液体颠倒或溢出接触到EP管口使RNA有所损失。挥发乙醇时尽量不要移动EP管，但可

39、用滤纸将管壁上的乙醇轻轻吸出，加入DEPC-H2O稀释保存RNA时要根据所提取RNA的量确定所加DEPC-H2O的量，避免将RNA浓度稀释得太低。总之，提RNA时动作既要稳又要快，避免RNA降解，提完RNA要尽快进行RT操作，将极不稳定的RNA逆转录成为较稳定的cDNA，为PCR做物质准备。在分离PBMC细胞时，如果是分离全血就与PBS按1：1的比例稀释，如果是成分血就与PBS按1：5的比例稀释。将稀释后的成分血加入淋巴细胞分离液一定要沿着管壁缓慢加入，尽量不要使血沉到分离液下面，要形成明显分层。用滴管小心抽取由PBMC构成的云雾层（由上到下第二层），因为第一层液体较多，可先吸走大部分第一层液

40、体，这样可方便吸云雾层，尽量不要抽取其他层的液体，以免分离的淋巴细胞杂质太多。离心细胞后去掉上清液时不要直接倒，用枪慢慢吸走，因为淋巴细胞体积较小，离心沉淀后还是比较松散，倒掉容易随液体倒走。 ELISA操作时要尽量减少孔与孔之间的操作差异，加样注意不要溅出或产生气泡，产生气泡可以减少标本与包被物的接触，降低试剂的敏感性。不要让吸头接触孔底部，以防破坏包被物。洗板时也要避免气泡残留在孔内，否则会因为洗掉液难以进入孔中而影响洗涤效果。5 结论Hh基因作为一种重要的胚胎形态发育调控因子，参与体内多种发育过程，包括神经管、四肢、细胞表型的定向诱导等，其缺失或减弱可引起多种发育缺陷和畸形。出生后，Hh

41、蛋白仅少量表达于呼吸道、消化道等上皮内的干细胞。Hh通路成员基因的异常表达则会启动靶基因转录，引起细胞异常分裂增殖，从而导致肿瘤形成11。大量研究证实Hh信号通路参与多种恶性肿瘤的发生与演进，可能的致癌途径有两个：1)通过配体Shh表达，内源性Shh过表达，并和受体Ptch结合，从而解除后者对下游因子Smo的抑制作用，促使全长的Gli进人核内启动靶基因；2)Ptch和(或)Smo发生突变，导致下游信号传导调节失控，靶基因不断激活12。大量研究显示肿瘤在本质上是一种干细胞疾病，长时间持续异常分裂的干细胞更像是累积突变、引起肿瘤的细胞。有关Hh信号通路和肿瘤干细胞的最新研究也指出：在部分恶性肿瘤中

42、，点突变导致Hh信号通路激活并持续作用于干细胞，致使其累积突变、异常分化为肿瘤干细胞，从而诱导肿瘤的生长与再发13。随着hedgehog信号通路的异常激活在越来越多的肿瘤中发现，人们对这个信号通路产生了浓厚的兴趣。由于“控制脊椎动物胚胎发育的信号通路可能与人类肿瘤的发生有关14”这一观点已逐渐被接受，国内外学者正逐步扩大hedgehog信号通路的研究范围，探索hedgehog信号通路与人类肿瘤(如子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌15等)之间的关系。但是目前在研究中还存在着一些问题，比如信号通路中是否还存在着其他的组成部分，对于信号增强后变异细胞的鉴别，cyclopamine的应用对于人体是否会产生其

43、他毒副作用，经多次使用后是否会产生耐药等。通过一些分子生物学技术改进和创新(比如cDNA微阵列，RNAi等)16.17 ，人们最终将全面了解此信号通路，从而为探讨肿瘤的发生机制以及治疗方案提供新的方向。参 考 文 献1 MoMer JRequirements for hedgehod，a segmental polarity gene in patterning larval and aduh cuticle of Drosophila Genetics，1988，120：1061-722 Forbes AJ，Nakano Y，Taylor AM，et a1Genetic analysis o

44、f hedgehog signalling in the Drosophila embryo Development(Cambridge，England)Supplement，1993：1 15-1243 Chen Y，Strum GDual roles for patched in sequestering and transducing HedgehogCel，1996，87：553-634 Marigo V， Roberts DJ， Lee SM， et a1 Oonmg， expression， an d chromosomal location of SHH an d IHH：two human homologues of the Drosophila segm ent polarity gene hedgehogCnomics，1995，28：44515 Odent S，Atti-Bitach T，Blayau M，et a1Expression of the Sonic hedgehog (SHH) gene during early human development and phenotypic expression of new mutations causing holoprosencephaly Human Molecular Genetics，1999