膜蛋白的提取与分离

1、膜蛋白的分离、简介：1细胞质膜资料 1895年Qverton从研究细胞透性得出"细胞膜由连续的脂类物质组成1925年 Gorter&Grendel: 用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总 面积，提出： "细胞膜是由双层脂分子组成 "。1935年 Danielli&Davson ：从测定膜的表面张力得出细胞膜的 "三明治结构模型 "，即蛋白质脂 -蛋白质。1959年Roberts。n:用电镜观察生物膜提出"单位膜模型"，将膜的分子结构与超微机构统一起来 厚度： 2(暗)+( 亮)+2 (暗) 细胞质膜的主要功

2、能概括如下：(1) 为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境(2) 选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排除，其中伴随着能量的传递；(3) 提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；(4) 为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；(5) 介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。2膜蛋白虽动物细胞主要有9种膜脂，而膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数 目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大 类型：外在膜蛋白、内在膜蛋白。(1)外在膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键

3、与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度 就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。(2)内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂(detergent)使膜解后才可分离出来。获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们显得非常的重要。1. J”Olyvopnriiw气丿7,I r 七eytaUAtaton附注：使用分级抽提方法获得的 膜蛋白”中只有很少一部分是具备多 跨膜区的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前为止，仍然是蛋白组学的一个瓶颈，不管采用2-D技术也好，ICAT乃至Proein microarray都 还不能有效解决这一问题。二、蛋白抽提 三、谈及蛋白分离，我们想

4、到：超速离心，盐析法、超滤法、凝胶过 滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分 溶、酶解法有时这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离 纯化。由于蛋白质种类繁多，不同的蛋白质由于结构和组成的差异， 其溶解度也各不相同 .根据蛋白质的溶解特性， 同时可选择不同的溶剂 提取，分为水溶液提取和有机溶剂提取 .四、但是针对膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于 它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉 胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化 的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，CHA PS一种离子去污剂）

5、，Emulgen和Lubrol等表面活性剂。五、1、分离膜蛋白的方法（原则性） ：六、1）先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃 度离心得到含有膜蛋白的粗组分。 （例如： michael11 液氮研磨组织， 加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。差速离心。蔗糖密度梯度离心。收 集37% 与41%间的成分，即为质膜部分。裂解即可收集膜蛋白） 七、2）用特殊的去污剂选择性的分离。从膜上提取蛋白有许多困难 在多数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来， 然后将蛋白质稳定 .去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效

6、率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的纯化步骤 .虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除 去去垢剂 .这常常会引起蛋白质失活，但如果蛋白质是用于测序的，他将不是一个问题 . 如果不是用于测序的， 可考虑使用能够黏附去垢剂的 疏水珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中， 都介绍有许多种不 同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂 .然而，他们并不是普遍适用的 . 在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如 triton X-100在280nm处有吸收，如果某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关，就 应避免使用这类去垢剂 .八、将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，

7、再进一步从细胞膜制剂中 将所需的膜蛋白增溶下来 .这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质 成分的混入 .使用这种方法所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数量上，都比酸溶解法所得到的蛋白( <5000Da )要多.一般提取的膜蛋白 量往往只占膜蛋白总量的不足 % ，所以充分的膜蛋白的提取，无疑对 于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的 .第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。一般的都是利用 4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，在温度超过20度时，此溶液分为水相和去污相;此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去

8、污剂相中。利用此性 质可提取膜蛋白。九、3 )膜蛋白色谱 (Chromatography of MembraneProtei n,CMP）CMP+分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰 石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（ P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大 小、SDS结合量有关。利用原子散射法研究 CAMP的分离机制发现,样品与SDS结合后在离子交换柱上存在 SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。十、层析柱提取（参步骤）十二、

9、4）顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。用 Tris 碱溶液裂解细胞提取高溶 解性蛋白；把未溶解的 pellet 用标准液溶解提取高疏水性蛋白；最后 用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前两次抽提后 不能溶解的膜蛋白。十三、 5)Centrifugal protein extraCtion .离心的CeltsTns extract!or10min vertex, 40 interval sonificatfoncentrifugepelletcytosolUreafThk)urea extractiOfilOmin vortex, 4

10、0 intervals sonrficalioncentrifugeI0fnmj2,000g, 25*CpeHetmembrane fractioni原理：高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨破裂后，超高速离心 评价：尽管分级（胞浆和胞膜）之间有清洗的步骤，但是可溶蛋白组分和膜蛋白组分之间仍然有不少重复的点.该方法相较MOLLOY MP教授在1998年electro phoresis上发表的分级抽提法减去了第rH 步（用tris抽提水溶性蛋白）和最后一步（极难溶蛋白）,在操作上也作了简化，总而言之 是一种不错的方法。（codegreen）6）detergent- based :提取时先裂解液裂胞膜（选用

11、不同的去污试剂是 关键），梯度离心分离细胞器（ER），然后分级抽提方法。例如，去掉 细胞器之后的DEBRIS就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是 裂胞膜时不溶的部分。总的感受：细胞的量要很充足。之后的定性鉴定常用的方法有双向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳等。纯化蛋白质浓度的定量 测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法定量鉴定膜蛋白，方便 迅速。到目前为止，提取膜蛋白仍然是蛋白学的一个瓶颈。2、分离膜蛋白的方法（操作）1）分离细胞膜蛋白的方法： 1冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液 A中，于室温与液氮罐中反复冻融 2次。2 5000转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。3取

12、上清12000转4度离心 10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。4 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液 C中提取后测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,mlLeupeptin,20uM pmsf(PH= buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,mlLeupeptin,20uM pmsf(PH= 1mM EGTA buffer C : ml Leupeptin,20

13、uM pmsf,50mMTris-cl(PH=,1、细胞放在冰上，去除上清，用 pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次2、加入 1ml2%TritonX 溶液冰浴 15min 3、刮下单层细胞， 4度下10 000g 5min 离心4、溶液37度水浴10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 OOOg离心5min5、收集水相留作分析 6、用 5OOul 冰冷的 buffer C 溶解去污剂相沉淀，冰浴 2min 后加温， 在按步骤 6再次离心 7、按步骤8再次抽提去污剂相，用 buffer C 将洗涤后的去污剂相稀释 到初始体积8、用等量的 buffer A 分别稀释水相与去污相，并进

14、行免疫沉淀实验 试剂：1、2%tritonX114:2%TritonX114 、 50mmol/L Tris HCl （pH7。 5）、蛋白酶抑制剂2、缓冲液 A （含0。5mol/LNaCI 的 RIPA buffer）3、buffer C 10mmol/L Tris HCl 150mmol/L NaCl 5mmol/L EDTA3）分离细胞膜蛋白的方法：7M urea 2M thiourea 4%chaps %sb3-10 1000000个细胞，可用此 buffer 1ml 。冰浴匀浆。冰上置 30分钟。4度高速低温离心 30min 。取上清-20保存。4）分离组织膜蛋白的方法： 1 、取

15、组织，加入 10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。2、J6-HC离心机800rpm , 4C离心10min后，所得上清液转入超速离心管。3、lOOOOOg , 4C离心1hr。弃去上清，沉淀用适量的 Buffer B重悬,冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机lOOOOrpm，4 °C离心 30min 。4、收集所得上清液即为膜组份。Buffer A :蔗糖，5mM Tris-HCl (PH ) , 120mM KCl, 1mM EDTA,1mMEDTA, PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/mlA

16、protinin 。冰上预冷。Buffer B: 20mM HEPES(PH )， 10%甘油， 2% Triton X-100, 1mMEDTA, 1mM EDTA, PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin 。冰上预冷。5）分离组织膜蛋白的方法：RIPA 1XPBS 1%NP40去氧胆酸钠%SDS以下用时加入10mg/ml PMSF 异丙醇（终浓度 10ul/ml ）Aprotinin (30ul/ml )1000mM Sodium Orthovandate ( 10ul/ml )冰冻组织 100mg/ 细胞1

17、000000个，可用 RIPA buffer 1ml 。冰浴匀浆。冰上置 30分钟。4度高速离心 30min ，20000转低温离心最佳。取上清-20保存。6）分离细菌膜蛋白的方法：于20ml营养肉汤中过夜培养细菌，37C, 200rpm。 lOOOOg、20min、4C离心，去上清。 20ml预冷的Tris-Mg缓冲液重悬，同样条件离心，再重悬于预冷的Tris-Mg 缓冲液。 超声波破碎细菌。 3000g, lOmin、室温下离心去除未破碎细菌。小心吸取上清（含有胞质成分和细菌外被成分）。 超速离心1: 1OO,OOOg，60min , 4 C,去除上清（胞质成分），收集细菌外被成分。 用1

18、0ml含2%的SLS的Tris-Mg缓冲液重悬沉淀物，室温温育2O-3Omin 。 超速离心II : 70,000g , 60min，室温沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含细胞质膜）。重复、两步。 充分吸除上清，并根据沉淀体积大小用ml的ddH20重悬沉淀物。根据公式：蛋白浓度（mg/ml）=D260测定外膜蛋白浓度，调节蛋白浓度至40ug/ul，该蛋白质样品-70 C贮存。试剂 Tris-Mg缓冲液10mM Tris-Cl 5mM MgCl2 pH , 4 C保存2%（w/v）十二烷基肌氨酸钠（SLS）7) 来源于 Methods Enzymology (1974)1. 取一定量酶处理的细胞，用

19、匀浆器破碎，操作要温和，使细胞膜保持完整。由于水与膜的疏水部分之间有反应，因此要精确掌握分离介质中的离心强度和渗透压，以每克细胞湿重加 40ml 介质。2. 用Potter-Elvehiem匀浆器，杆与壁间间隙一 g,min上下匀浆4 6次，每次 5S。3. 过滤匀浆液，150g离心10min，保留上清，沉淀部分加入50 "介 质，用匀浆器1kr/min匀浆3次，150g离心10min，沉淀部分再加入上 次匀浆的上清液。4. 合并3次上清液，2kg离心10min，弃上清，沉淀部分溶于100山介质，离心 10min ，弃上清，留沉淀。5. 将沉淀部分加入 70%蔗糖15份，然后分别置于

20、三个离心管中，上面依次叠加54% 、49%、45% ， 41%， 37%蔗糖溶液各 2、2、5、5、 3份。6. 700kg离心90min，分离介质在之间形成介面。7. 收集d为ml之间的细胞膜，力口 30倍的介质以离心10min，洗涤2次。8. 保存于 L Tris-HCl 缓冲液中，用于细胞膜的研究分析8）常用的制备粗制质膜组分的方法： （所有操作都在 4摄氏度下进行）1. 在冰冷的匀浆缓冲液中切碎组织块，倒出血水。用匀浆缓冲液漂洗组织碎块，并将它们置于冰上，重复上述操作，直至组织碎成 1mm3大小的碎片，且无可见的血。2. 加入5倍（体积比）与组织块体积的缓冲液，再置于冰浴的Dounce氏玻璃匀浆器中，抽研 10-20次，匀浆组织。3. 匀浆4摄氏度600g离心10min，上清含细胞膜、线粒体和细胞溶胶。沉淀中有未破碎的细胞及细胞核。弃沉淀。4. 上清4摄氏度8000g离心10min，沉淀线粒体。弃沉淀。5. 上清4摄氏度lOOOOg离心20min，弃上清。6. 用匀浆缓冲液重悬沉淀，继续匀浆，再次 4摄氏度， 10000g 离心20min ，弃上清。7. 用小体积的适宜缓冲液重新彻底匀浆沉淀。8 .粗制的样品可于干冰 /乙醇中速冻，保存于 -80摄氏度。9）用特殊的去污剂选择性的分离。 简单，可靠，但有时含有其他蛋白。原理：4度时所有的蛋