骨髓增生异常综合征造血干祖细胞体外增殖、分化特征研究

1、    骨髓增生异常综合征造血干/祖细胞体外 增殖、分化特征研究         我们对骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓CD34细胞进行检测和富集，并对富集后的骨髓细胞进行体外培养，以研究其增殖分化特征及对不同造血因子的反应。病例和方法1病例来源1993年3月1997年10月于我院住院的MDS患者29例，其中男性20例，女性9例；中位年龄37岁(2465岁)。按FAB诊断及分型标准111例为低危组(RA/RAS)，18例为高危组(RAEB/RAEB-t)。2试剂

2、来源所用单克隆抗体包括抗T细胞(CD3、CD2）、NK细胞(CD56)、B细胞(CD20)、粒细胞(CD11b)、红细胞(血型糖蛋白A-HIR2)抗体及其兔抗鼠二抗由我所免疫室提供，所用红细胞生成素(Epo)、重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)、重组人干细胞因子(rhSCF)、重组人白细胞介素3(rhIL-3)由麒麟公司惠赠，重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)由先灵葆雅公司提供。3实验方法3.1标本的采集：无菌采集肝素抗凝MDS及正常志愿献髓者髂骨或胸骨骨髓，密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞(MNC)。3.2造血干细胞的富集：去除单核细胞：采用粘附法去除MNC中的单核细

3、胞，即为M-MNC。阴性选择(Panning法)富集CD34细胞：用不同的单克隆抗体(包括T-细胞、B-细胞、成熟粒细胞、红细胞)与M-MNC反应，以清除T淋巴细胞、B淋巴细胞、成熟粒细胞、红细胞，即为富集后的造血干细胞(M-Ab-MNC)。3.3CD34细胞的检测：采用免疫荧光法。3.4体外生长特征分析：对M-Ab-MNC进行体外培养，观察长势。粒-巨噬系祖细胞(CFU-GM)集落和(或)集簇：1×105/L M-Ab-MNC 30g/L琼脂、体积分数为30%的小牛血清、10g/L谷氨酰胺的IMDM培养体系中，单独加入造血生长因子G-CSF(40ng/ml)、GM-CSF(100n

4、g/ml)、SCF(100ng/ml)、IL-3(40ng/ml)或加入不同组合造血生长因子(G-CSF+SCF、GM-CSF+SCF、IL-3+SCF)，孵育于体积分数为5%的CO2孵箱，观察1014d时集落和集簇数。爆式红系祖细胞(BFU-E)和红系祖细胞(CFU-E)集落：2×104/L M-Ab-MNC 300g/L甲基纤维素、100g/L牛血清白蛋白、体积分数为1%的二巯基乙醇、体积分数为30%的小牛血清、10g/L谷氨酰胺的IMDM培养体系中，加入Epo(2U/L)、Epo+IL-3(40ng/ml)和Epo+IL-3+SCF(100ng/ml)等造血生长因子培养于体积分

5、数为5%的CO2孵箱，观察BFU-E(1014d)、CFU-E(57d)集落产率。4统计方法采用t检验。结果1骨髓单个核细胞CD34表达率的测定1.1对29例MDS患者和6名志愿献髓者骨髓单个核细胞CD34抗原阳性表达率进行了检测，结果MDS患者骨髓单个核细胞中CD34细胞明显高于正常对照组，阳性表达率分别为7.03%和2.50%(P<0.01)，尤以高危组为著，高、低危组阳性率分别为9.65%和2.70%。1.2富集后CD34细胞比例为23.24%，平均富集倍数为3.3倍。富集后高、低危组MDS患者CD34阳性细胞比例(分别为24.12%和21.14%)虽高于正常对照组(17.7%)，

6、但差异无统计学意义(P值均>0.05)。2CFU-GM体外集落产率2.14种造血因子(rhSCF、rhIL-3、rhGM-CSF、rhG-CSF)单用和合用(rhSCF+rhIL-3、rhSCF+rhGM-CSF、rhSCF+rhG-CSF)对MDS患者富集后的CD34细胞进行CFU-GM培养，结果MDS患者CFU-GM集落产率明显低于正常组，而且主要以集簇为主，集落数明显少于集簇，而正常对照组则以集落为主，集簇少于集落数(表1)。2.2低危组MDS患者CFU-GM产率明显高于高危组MDS患者，且集簇与集落之比明显降低(表2)。2.3MDS患者骨髓富集后的CD34细胞对上述4种造血因子的

7、反应存在差别，对rhGM-CSF反应较好，并用rhSCF后可增加CFU-GM集落的产率，有利于集落的形成，而在rhIL-3单用或并用rhG-CSF因子体系中CFU-GM的产率均较低(表1，2)。3体外BFU-E和CFU-E长势MDS患者BFU-E和CFU-E集落产率均明显高于正常对照组(表3)。在Epo、Epo+rhIL-3及Epo+rhIL-3+rhSCF体系中随着造血因子的并用其BFU-E逐渐增多。高危组MDS患者BFU-E产率明显低于低危组MDS患者(表3)。4对5例MDS患者予标准联合化疗(柔红霉素40mg.m-2.d-1 ×3d和阿糖胞苷100mg.m-2.d-1×

8、;7d)和造血因子(Epo+rhG-CSF,rhG-CSF 300g/d,Epo 6000U/d，于停化疗后24h开始，连续57d)的治疗方案，其中2例患者1个疗程后获完全缓解(CR)，1例2个疗程后获CR，追踪观察68个月仍处于CR；2例治疗3个疗程无效而死亡。3例缓解的患者BFU-E生长良好，且CFU-GM生长也好于2例无效的患者。讨论本组研究结果表明，MDS患者骨髓干/祖细胞(CD34)数量虽高于正常，但其功能受到了严重的损害，在正常造血因子的调控下，CFU-GM集落形成能力明显减低，表现为集落产率明显减少，同时存在着分化异常，集簇明显多于集落，对各种造血因子反应降低，即使联合使用SCF

9、，其集落、集簇产率仍然明显减少，与国外报道相似2-5。表明MDS患者造血系统的改变是骨髓干/祖细胞本身质的异常所致，而非血清中存在其它抑制因子。虽然MDS患者骨髓CD34细胞对不同的造血因子反应存在异质性，但大部分患者骨髓干/祖细胞，在rhIL-3、rhG-CSF、rhGM-CSF和rhSCF 4种因子中对GM-CSF反应相对较好，其集落、集簇形成的能力较强，提示GM-CSF能部分促进MDS造血干/祖细胞的增殖和分化，为临床选择造血因子治疗MDS提供依据。表1正常对照组和MDS患者富集后CD34细胞在造血生长因子刺激下的CFU-GM产率(/1×105组别例数G-CSFGM-CSFIL

10、-3G-CSF+SCFGM-CSF+SCFIL-3+SCF正常对照组集簇51.00±0.161.00±0.473.00±1.124.20±1.011.40±0.311.00±0.42集落516.40±5.2735.60±7.4020.80±5.0725.60±7.0951.60±7.2728.00±5.83MDS组集簇265.20±2.0112.20±3.2421.90±9.3629.10±11.6221.10±8.6113.

11、90±5.40集落261.40±0.154.30±0.515.60±1.917.30±2.012.10±0.145.70±2.21     表2MDS患者高、低危组富集后CD34细胞在造血生长因子刺激下的CFU-GM产率(/1×105组别例数G-CSFGM-CSFIL-3G-CSF+SCFGM-CSF+SCFIL-3+SCFMDS高危组集簇1520.20±9.7326.20±8.9710.20±7.4319.20±8.5710.00&#

12、177;4.8422.50±11.08集落153.30±2.312.90±1.830.80±1.211.90±0.570.20±1.453.70±2.43MDS低危组集簇925.50±12.8135.50±15.3410.20±5.0719.20±8.6610.00±4.3422.50±13.64集落910.60±6.506.70±3.515.20±3.6514.00±9.874.20±2.215.70±3

13、.21     表3正常对照组和MDS患者富集后CD34细胞在造血生长因子刺激下的BFU-E和CFU-E产率(/2×104组别例数BFU-ECFU-EEpoEpo+IL-3Epo+IL-3+SCFEpoEpo+IL-3Epo+IL-3+SCF正常对照组537.00±7.7181.60±13.1898.00±16.1655.00±10.8481.00±19.43141.00±17.42MDS组25106.10±37.01152.90±46.37171.40±

14、54.38112.60±41.01189.30±55.95234.40±71.14高危组1488.20±32.31138.00±43.19148.40±41.4394.90±36.41185.40±58.04220.80±71.15低危组9172.70±48.41212.70±69.25292.90±88.31182.70±61.08204.00±58.47284.20±71.23     MDS患者骨髓富

15、集纯化后CD34细胞红系集落生长过度旺盛，即使在单独的Epo作用下，高危的MDS患者红系集落仍然生长良好，这与国外报道的不相一致6-8。在加用rhIL-3或并用rhIL-3与rhSCF后，其红系集落生长更为旺盛，但此组患者均有不同程度的难治性贫血，而且缺乏红细胞破坏过多的证据，此类红系集落生长与外周血血红蛋白值不相一致的现象，有待进一步研究。总之，我们的研究结果表明，MDS患者骨髓造血干/祖细胞数量及质量上均存在异常，且主要为质的异常。对于体外红系和粒系集落生长较好的患者采用标准化疗加造血因子治疗有利于提高其疗效。 基金项目：中国医学科学院基金(952040)、卫生部临床重点项目基金

16、(0007)、天津市自然科学基金资助项目(953608811)作者单位：陈桂彬（天津，中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院300020）邵宗鸿（天津，中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院300020）贾海蓉（天津，中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院300020）郑以州（天津，中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院300020）张益枝（天津，中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院300020）储榆林（天津，中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院300020）郝玉书（天津，中国医学科

17、学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院300020）参 考 文 献1，Third MIC Cooperative Study Group. Recommendations for a morphologic, immunologic, and cytogenetic (MIC) working classification of the primary and therapy-related myelodysplastic disorders. Cancer Gen Cytogenet, 1988, 32:1-10.2，List AF, Garewal HS, Sandberg AA.

18、 The myelodysplastic syndromes: biology and implications for management. J Clin Oncol, 1990, 81:1424-1441.3，Geissler K, Hinterberger W, Bettelheim P. Colony growth characteristic in chronic myelomonocytic leukemia. Leuk Res, 1998,12:373-377.4，Sullivan SA, Marsden KA, Lowenthal RM, et al. Circulating CD34 cells: an adverse prognostic factor in the myelodysplastic syndromes. Am J Hematol, 1992, 39:96-101.5，San Miguel JF, Sanz GF, Vallespi T,