实时荧光PCR和RT-PCR方法检测登革病毒的比较研究

1、实时荧光PCR和RT-PCR方法检测登革病毒的比较研究    #e#        作者：刘建军，古丽巴哈尔，阳 帆，陈家敏，何雅青，杨 洪【摘要】  目的  通过2种检测登革病毒方法的比较，以提高检测登革病毒的灵敏度和特异性。方法  利用Taqman MGB技术，根据登革病毒3端非编码区的一段高度保守序列，设计登革14型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针，以登革热毒株作为标准，以乙脑毒株作对照，建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对10份ELISA

2、法检测阳性的临床血清标本进行RT-PCR及荧光PCR扩增。结果  RT-PCR检测10份临床血清标本，2份阳性，阳性率为20%。实时荧光PCR检测登革病毒与乙脑病毒无交叉反应，检测10份临床血清标本，5份阳性，阳性率为50。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论  Taqman MGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强，可作为登革病毒的快速检测方法，应用于登革热的临床早期诊断。        【关键词】  登革病毒；RT-PCR；Taqman GMB实时PCR   &#

3、160;        【Abstract】  Objective  In order to improve the sensitivity and specificity of detecting dengue viruses， two methods for detecting dengue viruses were compared.Methods  Using Taqman MGB technique， a pair of universal primers and Taqman MGB

4、 probe were designed according to a highly reserved sequence of the 3-noncoding region of dengue viruses type 1-4. Dengue virus strains were used as standard and Japanese encephalitis virus strains were used as control， the real-time PCR assay for specific and sensitive detection of the dengue virus

5、es was established. While 10 serum specimens of ELISA positive were detected by the RT-PCR and fluorescent PCR.Results  There was no cross-reaction with Japanese encephalitis virus. Of 10 specimens， 2 was positive by RT-PCR and 5 was positive by real-time PCR. The test could be completed in 4 h

6、ours.Conclusion  The Taqman MGB real-time PCR assay was fast， sensitive and specific. It could be applied to the quick early diagnosis of dengue viruses.       【Abstract】 dengue virus；RT-PCR；Taqman GMB real-time PCR        登革热是流行于

7、热带、亚热带地区的一种急性虫媒传染病，其病原体为登革病毒，近年来随着全球气候变暖和国际旅游的增多，登革病毒感染呈扩大蔓延之势，发病率不断升高。由于缺乏疫苗和有效的防治措施，因此对该疾病实行早期诊断十分必要。        登革病毒属于黄病毒科黄病毒属， 为单股正链病毒，基因组长约11。依抗原性不同分为1、2、3、4四个血清型(14)1，2。登革病毒感染的实验室诊断，传统方法是从患者血清中分离病毒，或用血清学方法检测病毒的特异性抗体。但病毒分离费时，检测血清抗体需分别在患者感染的急性期及恢复期采集双份血清， 同时存在广泛的交叉反应而受到

8、干扰3，这些均不利于疾病的早期诊断。近年来国内外均有报道应用RT-PCR检测登革热病毒4，但RT-PCR方法容易造成污染，同时也存在从临床血清标本中检测登革病毒敏感性不够的问题。这就需要建立一种更敏感、特异和快速的检测鉴定方法，以实现对登革热患者的早期快速诊断，为预防控制登革热的流行赢得时间。本研究比较了利用TaqmanMGB探针技术的实时荧光PCR和RT-PCR方法检测登革病毒特异性，以期选择特异性好、灵敏度高的检测方法，达到快速诊断登革热的目的。        1  材料与方法   

9、60;   1.1  毒株及血清标本  登革病毒14型标准株由广东省疾病预防控制中心提供，乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株由成都生物制品所提供。血清标本采自深圳市近几年发病2周内的疑似登革热病人和发病10天内的疑似乙脑病人，-80保存。        1.2  主要试剂  病毒RNA提取试剂盒为Roche公司产品，TaqDNA聚合酶、PCRbuffer、MgCl2、随机引物购自Invitrogen公司，dNTP购自上海生工公司， AMV逆转录酶、RNaseinhibitor购自

10、大连宝生物公司，引物和荧光探针由上海基康生物技术有限公司合成及标记，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。        1.3  主要仪器设备  Centrifuge 5415D台式高速离心机购自德国Eppendorf公司， Ultrospec 2000紫外可见光蛋白核酸分析仪购自美国GE公司， 9700基因扩增仪购自美国ABI公司，Gene Genius凝胶成像分析系统购自英国Syngene公司， Mx4000荧光PCR仪购自美国Stratagene公司。      &#

11、160; 1.4  引物及探针设计  在GeneBank上检索登革病毒4个血清型中都一致的高度保守序列，根据登革病毒(DEN)聚合蛋白基因的一段高度保守序列，设计登革14型RT-PCR通用引物，扩增片段长度为511bp。根据DEN 3端非编码区的一段高度保守序列，设计登革14型荧光PCR通用引物和Taqman探针，探针5用FAM报告荧光基团标记，3用MGB淬灭荧光基团标记，扩增片段长度为68bp。        登革病毒RT-PCR通用引物：       

12、 Den-D1： 5 TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG3        Den-D2： 5 TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC3        登革病毒荧光PCR通用引物：        Den-FP： 5 GCATATTGACGCTGGGAGAGA3        Den-RP： 5GGCGTTCTGTGCC

13、TGGAAT3        登革病毒通用探针：        Den-Probe：5 FAMCAGAGATCCTGCTGTCTCMGB3        引物和探针均由上海基康生物技术有限公司合成及标记。        1.5  病毒RNA提取  14型登革病毒标准株用1640培养液溶解，接种C6/36细胞，传代次，按病毒RNA提取试剂盒

14、说明书操作，提取病毒RNA，RNA置-80保存备用。        1.6  反转录及普通PCR         RNA逆转录  反应总体积为20l，在反应管内依次加入：5×缓冲液5l，2.5mmol/L 4×dNTP 1l，0.3g/l Random（Invitrogen公司生产）引物1l，提取的RNA 12l，AMV逆转录酶（10u/l）1l混匀。反应条件为：42 60min95加热5min4保存。然后将产物放置

15、于-20备用。         PCR扩增  反应总体积为20l，在反应管内依次加入：10×缓冲液2l，2.5mmol/L，4×dNTP 1l，25mmol/LMgCl2 2.5l，通用引物D1、D2（5mol/L）各1l，RT产物0.5l（型，型，型）、2l（型，血清标本，阴性对照），Taq酶（5u/l） 0.25l，加H2O补足体系。反应条件为：94 5min94 30s，60 30s，72 30s，循环40次72延伸10min4保存。     

16、60;    扩增产物电泳分析  配制含溴乙锭的1.5%琼脂糖凝胶，取10lPCR产物电泳，在凝胶成像仪上观察并照相记录实验结果。        1.7  实时荧光PCR  反应总体积为25l，在反应管内依次加入：10×缓冲液2l，10mmol/L 4×dNTP 0.75l，50mmol MgCl2/L 2.5l，引物Den-FP，Den-RP（10mol/L）各0.5l，探针Den-probe（5mol/L）0.6l，RT产物0.5l（型，型，型）、2l（型，血清

17、标本，阴性对照），Taq酶（5u/l）0.25l，加H2O补足25l体系。反应条件是：50 2min95 10min95 30s60 30s，循环40次4保存。采用MX4000实时荧光PCR扩增仪进行扩增，延伸阶段检测荧光。        2  结果        2.1  普通RT-PCR检测结果  14型登革病毒标准株、10份发病2周内疑似登革病毒感染病人血清，其IgM、 IgG检测为阳性，乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株进行RT-PCR检测，

18、在511bp处14型登革病毒标准株都出现了目的基因条带，10份疑似登革病毒感染病人血清只有2份出现目的基因条带，其他标本都为阴性，见图1。说明此RT-PCR检测体系具有良好的特异性。        注： DNA分子质量标准；14分别为型登革毒株；        513血清标本（其中5和8为同一标本）；            14、15为乙脑病毒对照；-为空白对照

19、60;                 图1  登革型毒株和血清标本PCR扩增结果        2.2  登革病毒Taqman MGB PCR体系检测结果         有效性检验  按1.7方法，分别提取登革病毒14标准株RNA，进行反转录的实时PCR，14型均观察到荧光信号增强。&

20、#160;         特异性分析  登革病毒14标准株、乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株经TaqmanMGB体系检测，只有登革病毒14标准株观察到荧光信号增加外，乙脑病毒疫苗株、乙脑病毒强毒株均没有荧光增加信号，见图2。这证明了此TaqmanMGB检测体系的特异性。          登革病毒TaqmanMGB PCR检测体系的应用  用型登革病毒作为阳性对照，对10份发病2周内疑似登革病毒感染病人血清，其IgM、 IgG检测为阳性，8份发病

21、10天内疑似乙脑病毒感染病人血清作为对照，其IgM、 IgG检测为阳性。进行TaqmanMGB PCR检测，结果只有5份疑似登革病毒感染病人血清出现荧光信号增加，其他血清标本均无荧光信号。见图3。注：1、2、3、4分别为、登        革病毒标准株                   图2  登革病毒荧光PCR特异性分析  

22、      注：1：型登革病毒标准株；        26：疑似登革病毒感染病人血清标本                图3  血清标本荧光PCR检测结果        3  讨论        Taqman探针是一条与病原体核酸特异性结合的荧光素标记探针，它的结合位点位于普通PCR的2条引物之间5。探针的5端和3端分别标记报告荧光基团和淬灭荧光基团，PCR扩增在加入一对引物的同时加入荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR扩增时， Taq酶发挥它的53的外切酶功能，将探针切成单核苷酸，5