WATERS2695-2487HPLC仪器操纵简明步骤

1、WATERS 2695-2487 HPLC仪器操作简明流程WATERS 2695-2487 HPLC 仪器操作简明流程1、2487 检测器开、关机及使用：实验完毕关掉电源开关即退出。打开电源 仪器自检 1-2min 预热 5min 稳定约 30min 设定通道、 波长模式、 波长（也可在工作站上设置） 回零（ Auto Zero ） 分析检测2、2695 分离单元使用操作：4-5min ），待屏幕上方出现“ Idle ”字样表示自检成功。”键进入“ Status （ 1）”界面，移动光标 至“ Degasser Mode ”，按 Enter1）开机自检 打开电源开关，仪器开始自检（2）脱气（

2、Degas ） 按面板右下方“ Menu/Status选择“ On ”，打开在线脱气。3）设定柱温（可选项）在“ Status （1 ）”界面，移动光标至“ Col Htr Set ”，输入目标温按 Enter 即可。（可在工作站方法中设置）4）Prime Seal Wash （清洗柱塞杆）按“Menu/Status ”键回到“Menu ”界面，按下排功能键“Diag ”，然后再按下排功能键 “Prime Seal Wsh ”, “Start ”，冲洗 12min 后， “ HALT ” ， “ CLOSE ” 。5）Wet Prime在“ Status （1）"界面中“ Com p

3、osition ”下，选择将用到的溶剂通道为 “100% ”，按液晶屏幕右下角“ Direct Function ”键，移动光标选择“ 2 Wet Prime ”，“OK ”，流速及时间可使用默认值，也可自行设定（如： 5ml/min ，3min），“OK” 即可。将每一个会用到的溶剂通道按照上述操作一次。6）Purge Injector （注射器排气泡及清洗）进入“ Direct Function ”界面后，选择“ 3 Purge Injector ”，“OK”，默认数值为 6， “OK”。7）Prime Needle Wash （清洗注射针）进入“ Diagnostics ”界面，按下排功

4、能键之“ Prime Ndl Wsh ”，“Start ”，默认30秒钟，“Close ”，即 可返回“ Diagnostics ”界面。4）。注：以上 4） -7）为溶剂系统前处理过程， 建议每天开机后依次进行。 若发现注射器中有气泡， 则可重复 6） 直至排除。如果流动相中含有盐类，则实验结束后必须用水清洗柱塞杆（即操作8）平衡柱子在“ Status（ 1） ”界面上，按流动相比例设定各通道溶剂比例后，再Wet Prime操作一次，然后设置流速，平衡色谱柱 30-60min 。9）放置样品 拉开样品转盘舱门，将盛有待测样品溶液的样品瓶放入转盘中，记下样品瓶号，关上舱门。10）检测样品 打开

5、工作站，设置仪器方法、方法组、自动进样序列等，监视基线、检测样品。11）分析处理数据、打印报告12）清洗注射器、针、柱塞杆 参见上述 4）、 7）。13）清洗色谱柱用水冲洗柱子 40-60min （视柱子规格不同， 流速通常 1ml/min ）；然后用甲醇或乙腈冲洗柱子 40min （流 速 1ml/min ）。14）关机 关掉电源开关。 另外有相关注意资料1、检测器波长范围： 190-700nm2、3、4、5、可以进行紫外扫描（ scan ），参考媒体播放 清洗柱塞杆的溶剂可以用水，或 5%-10% 甲醇（抑菌） 清洗针的溶剂可以根据样品溶解性选择，如甲醇，或异丙醇-水（ 1：1）清洗柱塞杆

6、操作“ prime seal wash ”“ start ”后，看有溶液流出，持续一段时间后，按下“ HALT ”，“CLOSE” 冲洗 1-2min 即可， 1 次。可以每天开机后进行，或结束实验时进行。流动相中有盐，结束实 验时一定要清洗。仪器不自动进行。6、START UP DIAGNOSTICS; WATERS ALLIANCE每次仪器打开后，会自动进行的操作有：SEPERATIONS MODULE, REV2.03, INITIALIZING; INITIALIZING NEEDLE SYRINGE; INITIALIZING CAROUSELS; INITIALIZING SOLV

7、ENT SYSTEM; IDLE （在屏幕上有显示）“实验结束后要 purge injector ”， 1 次即可，包括了“ purge sample loop ”。 在线脱气机打开后，开始时运行加速，使压力很快降到 1.0psi 以下，然后维持在 0.5psi 左右。 怀疑管路堵塞可卸下单向阀、在线过滤器进行清洗。单向阀安装注意方向。7、8、9、10、11、12、本仪器配置注射器体积 250ul ，样品环 100ul 。可在“ CONFIG ”中查看。 样品环体积可换；但同时注射器体积也应匹配。注射器体积有25 、100 、250 、 2500 等。在检测器中“ DIAG ”中可以查看“ S

8、AMPLE ENERGY ”、“REFERENCE ENERGY ”等参数，了解紫外灯的使用情况。检测器要经常用“ SHIFT +3 ”来校正波长，保证其准确性。每 1-2 周检查 1 次。先清洗检测池。清 洗检测池可以在线进行，不用卸下；具体操作是，用双向接头替代色谱柱，流速设置为 0.45m 滤膜过滤过的甲醇冲洗 15min-30min 即可达到清洗目的。13、1ml/min ，用14、2 台仪器可以共用一个工作站（工作站升级为多系统） ；但 2 台仪器不能同时用一个项目采集样品。基线平衡后纵坐标可达到小数点后第 4 位（很平稳）。 可单针自动进样，也可以成组进样；

9、成组进样需要编辑样品组方法（包括瓶号、样品名、进样体积、 进样次数、功能、方法组 / 报告方法、下一针延迟等） 。样品组方法可保存、调用。 （ctrl +D 可以用于列复 制是“下同”之意。 ）样品组方法里的“功能”一项，有“平衡”及“平衡色谱柱”两个选项，其功能不同；若仪器方法15、16、17、选用梯度，用“平衡色谱柱”可以在进样前运行梯度来平衡柱子；而如果选用“平衡”则只是按照初始梯 度条件等度平衡柱子。 （当然，如果是用等度的流动相条件，则两者没有区别） 18 、 编辑仪器方法时注意：0.3 时，选 25；流速在。“针头深度”除样品瓶选用内插管时设为 2 ，其余均用默认值1） 2695

10、“通用”标签下，“单次输送体积”数值根据流动相流速不同有别：流速V0.3-1.0 时，选 50 ;流速 1.0 时，选 1000。2）3）4）5） 2487 在 其余不动 。脱气”流量”溶剂”标签下， “脱气模式”选择“开” 中编辑流动相比例及梯度条件； 为可选备注项。其余“事件” 、 通用”标签下选择“波长模式”即可。“温度”标签下，可以启用柱温设置“目标柱温”等。通道”不用设置。，启用通道；在相应“通道 1 ”或“通道 2”下设置波长即可，6） AUFS 值在此仪器中没有启用，不改变面积大小。19 、 注射器中的气泡快速有效排除方法：可以小心的卸下注射器抽吸甲醇排除气泡后，注射器中保留少量

11、溶剂，做“ purge injeCtor ”小心安装上，再做几次“ purge injeCtor ”观察没有气泡即可。 其他方法，如 WATERS 工程师讲可以在“ purge injeCtor ”开始后、注射器杆向上时，拧掉下边螺丝，上 下抽推排除气泡。溶剂用甲醇较好；不用同时拧掉上方注射器。20、21、检测器开机自检结束时有时会提示“ Calibration differs.521nm ” ,这是仪器自检后提示与上一次自 检结果有出入，原因很多，可能是检测池中有小气泡，检测池污染，也可能是流路中溶剂有变动。分析原 因，清洗检测池，排气泡，或者请工程师帮助。要注意样品瓶中死体积大小，防止供试

12、液体积不足，针头吸不到。HPLC 日常维护办法之一：压力异常操作压力的变化往往是故障的征兆。从下表中找出所观察到的现象，并在右侧的列表中参考相应的解决方 法。A、没有压力显示，没有流动相流动 原 因 解决方法1、电源问题 1 、接通电源，开机2、保险丝被烧坏 2、更换保险丝3、 控制器设定不正确或设定失败3、a、采取恰当的设定 b、修理或更换控制器 4、柱塞杆折断 4 、更换柱塞杆5、泵头内有空气 5 、溶剂脱气、启动泵抽出空气6、流动相不足 6、a、补充流动相 b 、更换入口滤头7、单向阀损坏 7 、更换单向阀8、漏液 8 、拧紧或更换手紧接头B、流动相流动正常，但没有压力显示 原 因 解决

13、方法1、仪表损坏 1 、更换仪表2、压力传感器损坏 2、更换压力传感器C、压力持续偏高原 因 解决方法1、流速设定过高 1 、调整流速设定2、柱前筛板堵塞 2、a、在允许情况下反冲色谱柱 b 、更换筛板C、更换色谱柱3、流动相使用不当或缓冲盐的结晶沉淀3、a、使用恰当的流动相 b 、冲洗色谱柱4、色谱柱选择不当 4 、选择恰当的色谱柱5、进样阀损坏 5 、清洗或更换进样阀6、柱温过低 6、提高温度 7、控制器失常 7 、修理或更换控制器8、保护柱阻塞 8 、清洗或更换保护柱9、在线过滤器阻塞 9 、清洗或更换在线过滤器D、压力持续偏低1、因 解决方法流速设定过低 1 、调整流速2、系统漏液 2

14、 、确定漏液位置并维修原因 解决方法3、4、5、控制器失常 5 、维修或更换控制器E、压力不断上升色谱柱选择不当 3、选择恰当的色谱柱柱温过高 4、降低温度因 解决方法1、见列表 C 1 、见列表 CF、压力降为零因 解决方法1、见列表 A、B 1、见列表 A、BG、压力不断下降，但不回零原 因 解决方法1 、见列表 D 1 、见列表 DH 、压力波动 原 因 解决方法1、泵中有气体1、a、溶剂脱气b 、从泵中除去气体2、单向阀损坏2 、更换单向阀3、泵密封损坏3、更换泵密封4、脱气不充分4、a、溶剂脱气b 、改变脱气方法（使用在线脱气法等）5、系统漏液 5 、确定漏液位置并维修6、使用梯度洗

15、脱 6 、由于流动相粘度的变化引起的压力波动HPLC 日常维护办法之二：漏液 通常可以通过拧紧或更换管路接头来解决漏液的问题。但值得注意的是过份拧紧会导致金属接头的漏液和 塑料接头的磨损。如果通过稍微拧紧接头不能解决漏液的问题，就必须将接头取下，检查是否损坏（例如， 卡套损坏、密封表面有杂质） ；损坏的接头应该更换掉。A 、接头处漏液1、接头松动 1 、拧紧2、接头磨损 2 、更换3、接头过紧3、a、拧松，再重新拧紧b、更换4、接头被污染 4、a、拆下清洗b、更换5、部件不匹配 5 、使用同一品牌的配件B、泵漏液原 因 解决方法1、单向阀松动1、a、拧紧单向阀（不必拧的过紧） b 、更换单向阀

16、2、接头松动 2、拧紧接头（不必拧的过紧）3、 混合器密封损坏 3、a、更换混合器密封 b、更换混合器 4、泵密封损坏 4 、维修或更换泵密封件5、压力传感器损坏 5 、维修或更换压力传感器6、脉冲阻尼器损坏 6 、更换脉冲阻尼器7、比例阀损坏 7、a、检查隔膜，如果漏液立即更换b、检查手紧接头，损坏的立即更换 8、放空阀的损坏 8、a、拧紧放空阀 b、更换放空阀C、进样阀漏液原 因 解决方法1、转子密封损坏 1 、重新安装或更换进样阀2、定量环阻塞 2 、更换定量环3、进样口密封松动 3、调整4、进样针头尺寸不合适4、使用恰当的进样针 5、废液管中产生虹吸 5 、保持废液管高于废液液面6、废

17、液管阻塞 6 、更换或疏通废液管D 、色谱柱漏液 原 因 解决方法1 、尾端接头松动 1 、拧紧接头2、卡套内有填料 2 、拆下、清洗卡套、重新安装3、筛板厚度不合适 3、使用合适的筛板（参考下表）筛板选择指导 物质粒径 筛板孔径3-4u 0.5u 5-20u 2uE检测器漏液原 因 解决方法1、流通池垫片损坏 1、a、避免过大的背景压力（压力降） b 、更换垫片2、流通池窗破碎 2 、更换窗口3、手紧接头漏液 3 、拧紧或更换4、废液管阻塞 4 、更换废液管5、流通池阻塞 5 、重新安装或更换HPLC 日常维护办法之三：谱图的各种问题 液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。其中有一些问

18、题可以通过改变设备参数得到解决；而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。A、峰拖尾因 解决方法1、筛板阻塞1、a、反冲色谱柱 b、更换进口筛板c、更换色谱柱2、3、色谱柱塌陷 2 、填充色谱柱干扰峰3、a、使用更长的色谱柱b 、改变流动相或更换色谱柱4、流动相 PH 选择错误 4 、调整 PH 值。对于碱性化合物，低 PH 值更 有利于得到对称峰5、样品与填料表面的溶化点发生反应5、a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂b、更改色谱柱B、峰前延因 解决方法1、柱温低 1 、升高柱温3、4、色谱柱损坏 4、见 A1 、 A22、样品溶剂选择不恰当

19、 2、使用流动相作为样品溶剂样品过载 3、降低样品含量C、峰分叉原 因 解决方法1、保护柱或分析柱污染图 1 、取下保护柱再进行分析。 如果必要更 换保护柱。 如果分析柱阻塞， 拆下来清洗。 如果问题仍然存在， 可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或 更换色谱柱。2、样品溶剂不溶于流动相2、改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。D 、峰变形因 解决方法1、样品过载 1 、减少样品载量E、早出的峰变形因 解决方法1、样品溶剂选择不恰当1、a、减少进样体积b 、运用低极性样品溶剂F、早出的峰拖尾程度大于晚出的峰原 因 解决方法1、柱外效

20、应1、a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路）b、使用小体积的流通池G、 K '增加时，脱尾更严重 原 因 解决方法1、二级保留效应，反相模式 1、a、加入三乙胺（或碱性样品）b 、加入乙酸（或酸性样品） C、加入盐或缓冲剂（或离子化样品） d 、更换一支柱子2、二级保留效应，正相模式 2、a、加入三乙胺（或碱性样品）b、加入乙酸（或酸性样品）C、加入水（或多官能团化合物） d、试用另一种方法3、二级保留效应，离子对 3、加入三乙胺（或碱性样品）H、酸性或碱性化合物的峰拖尾原 因 解决方法1、缓冲不合适1、a、使用浓度50-100mM的缓冲液b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液I

21、、额外的峰 原 因 解决方法1 、样品中有其他组份1 、正常2、前一次进样的洗脱峰b 、提高流速2、a、增加运行时间或梯度斜率3、空位或鬼峰 3、 a、检查流动相是否纯净b 、使用流动相作为样品溶剂c、减少进样体积J、保留时间波动因 解决方法1、2、3、温控不当 1 、调好柱温流动相组分变化 2、防止变化（蒸发、反应等）色谱柱没有平衡 3、在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱K、保留时间不断变化因 解决方法1、流速变化 1 、重新设定流速2、泵中有气泡 2、从泵中除去气泡3、流动相选择不恰当3、a、更换合适的流动相b 、选择合适的混合流动相L、基线漂移原 因 解决方法1 、柱温波动。（即使

22、是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵 敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。 ）1 、控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器 图2、流动相不均匀。 （流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。 ）2、使用 HPLC 级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。3、流通池被污染或有气体1N 的硝酸。（不要用盐酸）3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用 4、检测器出口阻塞。 （高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）4、取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。5、流动相配比不当或流速变化 5、更

23、改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。10-20 倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时6、用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成7、检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC 级的溶剂8、样品中有强保留的物质（高K '值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。8、使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。9、使用循环溶剂，但检测器未调整。9、重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。10、检测器没有设定在最大吸收波长处。10

24、、将波长调整至最大吸收波长处M 、基线噪音（规则的） 原 因 解决方法1、在流动相、检测器 1 、流动相脱气。冲洗系统以除去 或泵中有空气 检测器或泵中的空气。2、漏液 图 2、见第三部分。检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。3、流动相混合不完全 3 、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂4、温度影响（柱温过高，检测器未加热）4、减少差异或加上热交换器5、在同一条线上有其他电子设备 5、断开LC、检测器和记录仪, 检查干扰是否来自于外部，加以更正。6、泵振动 6 、在系统中加入脉冲阻尼器N 、基线噪音（不规则的） 原 因 解决方法1、漏液 图 1

25、、见第三部分。检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和 不正常的噪音。如有必要，更换密封。 检查流通池是否漏液。2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成2 、检查流动相的组成。3、流动相各溶剂不相溶 3 、选择互溶的流动相4、检测器 / 记录仪电子元件的问题4、断开检测器和记录仪的电源，检查并更正。5、系统内有气泡 5 、用强极性溶液清洗系统6、检测器内有气泡 6 、清洗检测器，在检测器后 面安装背景压力调节器7、流通池污染（即使是极少的污 7 、用 1N 的硝酸（不能用磷酸） 染物也会产生噪音。 ） 清洗流通池8、检测器灯能量不足 8 、更换灯9、色谱柱填料流失或阻塞 9 、更换色谱柱10、

26、流动相混合不均匀或混合器工作不正常 10 、维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，O 、宽峰建议不使用泵的混合装置因 解决方法1、2、流动相组成变化流动相流速太低1、重新制备新的流动相2 、调节流速3、漏液（特别是在柱子和检测器之间）3 、见 section 3 。检查接头是否松原因 解决方法动、泵是否漏液、是否有盐析出以 及不正常的噪音。如果必要更换密封。4、检测器设定不正确 4 、调整设定5、柱外效应影响 a、柱子过载 b、检测器对反应时间或池体积响应过大C、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大 d、记录仪响应时间太长a、图 5、小体积进样（例如： 10ul 而不是 100ul ）以

27、1：10 或 1：100 的比例稀释样品b、减少响应时间或使用更小的流通池C、使用内径为 0.007-0.01 的短管路d 、减少响应时间6、缓冲液浓度太低 6 、增加浓度7、保护柱污染或失效 7 、更换保护柱8、色谱柱污染或失效，塔板数较低8、更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶 剂冲洗旧柱子。9、柱入口塌陷 9 、打开柱入口，填补塌陷或更换柱子10、 呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰10、选择其它类型的色谱柱以改善分离效果11、柱温过低11、提高柱温。除非特殊情况，温度不宜超过 75 C12、 检测器时间常数太大12、使用较小的时间常数P、分离度降低因 解决方

28、法1、流动相污染或变质（引起保留时间变化）1 、重新配置流动相2、保护柱或分析柱阻塞2、去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞，可进行反冲。如果问题仍然存在 色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更 换入口处的筛板或更换色谱柱。Q、所有的峰面积都太小1、检测器衰减设定过高 1、减少衰减的设定2、检测器时间常数设定太大2、设定较小的时间常数3、进样量太少 3 、增大进样量4、记录仪连接不当 4、使用正确的连接R所有的峰面积都太大1、因 解决方法 检测器衰减设定过低 1、采取较大的衰减2、进样过多 2、减少进样量3、记录仪连接不

29、正确 3 、正确连接记录仪原 因 解决方法2、溅出2、a、检查废液瓶是否已满HPLC 日常维护办法之四：进样阀的问题 以下问题在使用进样阀过程中有可能发生。A、手动进样阀，转动不灵原 因 解决方法1、转子密封损坏 1 、更换或调整转子密封2、转子太紧 2、调整转子的松紧度B、手动进样阀，载样困难1、因 解决方法进样阀安装不当 1 、重新安装2、定量环阻塞 2 、清洗或更换定量环3、进样器污染 3 、清洗或更换进样器4、管路阻塞 4 、清洗或更换管路C、自动进样阀，不能转动1、因 解决方法无压力（或电源） 1、提供恰当的压力（电源）2、转子太紧 2、调整转子的松紧度3、进样阀安装不当 3、重新安

30、装D、自动进样阀，其它问题因 解决方法1、阻塞 1 、清洗或更换阻塞部件2、机械故障 2 、见随机维修手册3、控制器故障 3 、维修或更换控制器HPLC 日常维护办法之五：由气味、景象和声音可以发现的问题 你需要运用你所有的感官去发现液相色谱的问题。你最好养成习惯，每天花上几分钟运用你的感官（除了 味觉）来“感觉”你的液相色谱是否存在问题，这样可以帮助你迅速找到问题所在。例如：在你看到漏液 之前，你可能首先闻到它的气味。大部分的问题是可以通过眼睛看到。A、溶剂的气味 1、漏液 1 、见 section 3 b、找到溅出的部位并清洗干净B、热气味原 因 解决方法1、仪器过热1、a、检查并调节通风

31、设施b 、检查并调节温度设定c、C、关掉仪器，查找维修手册读数不正常1、因 解决方法 压力不正常 1 、见 section 22、柱温箱问题 2、a、检查并调节设定 b、参照用户手册3、检测器灯失效 3 、更换灯D 、灯警告 原 因 解决方法1、压力超出极限值1、a、检查是否阻塞2、b、检查并调节极限值的设定 其它警示灯 2、见用户手册E、警告音因 解决方法1、溶剂泄漏 /溅出 1、找到并解决2、其它警告音 2 、见用户手册F、刺耳的短音或长音因 解决方法1、2、轴承失效润滑不够1 、见用户手册2、进行恰当的润滑3、机械故障3 、见用户手册HPLC 日常维护办法之六：常见故障及日常维护 下表中

32、列出了液相色谱常见的一些问题，右侧中则列出的日常维护的方法可以减少问题出现的频率。括号中的数字是建议进行维护的时间间隔。用户手册则提供您更多的维护方法。溶剂瓶问 题 维 护1、 进口筛板阻塞 1、a、更换（3-6个月）b、过滤流动相，0.5U滤膜2 、流动相脱气2、气泡泵问 题维护1 、气泡1 、流动相脱气2、泵密封损坏 2 、更换（ 3 个月）3、单向阀损坏 3 、过滤流动相，运用在线过滤，准备备用单向阀进样阀问 题 维1 、转子密封损坏1、a、不要拧的过紧 b、过滤样品色谱柱问 题 维1 、筛板阻塞 1 、a、过滤流动相 b、过滤样品c、运用在线过滤或保护柱 2、柱头塌陷2、a、避免使用PH>8的流动相（针对大部分硅胶的柱子） b 、使用保护柱 c 、使用预柱（饱和色谱柱） 检测器问 题 维 护1、 灯失效