超滤法提取纳豆激酶的技术参数优化

1、食品科技2010年第35卷第5期FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY提取物与应用超滤法提取纳豆激酶的技术参数优化陈景鑫，刘妍妍，沙维，张丽萍*(黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆163319)摘要：目的：研究超滤系统中超滤压力、超滤温度、料液pH值主要参数对膜通量的影响，确定超滤分离纳豆激酶的最佳工艺条件。方法：以实验室制备的纳豆激酶粗酶液为原料，经超滤分离，层析分离确定纳豆激酶的比活力、纯化倍数及回收率。结果：最佳超滤压力为0.25MPa、料液温度为37、料液pH为7；可得到比活力为9610.46IU/mg、纯化倍数为2.36、回收率为92.3%的酶液，酶液经HPD-400树脂洗脱

2、得到单一蛋白峰，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，表现为单一蛋白条带，相对分子质量约为28000u。结论：采用超滤技术对纳豆激酶进行分离提纯，可提高酶活性及回收率，技术参数可行。关键词：纳豆激酶；超滤；比活力；纯化倍数；回收率中图分类号：TQ925文献标志码：A文章编号：1005-9989(2010)05-0225-05StudyontechnologyforextractingnattokinasebyultrafiltrationCHENJing-xin,LIUYan-yan,SHAWei,ZHANGLi-ping*(TheFoodScienceofHeilongjiangBayiAgricu

3、lturalUniversitiy,Daqing163319)Abstract:Objective：Studyedtheimpactofmembranefluxonutrafiltrationsystempressure,ultrafiltrationtemperatureandpH,determinedtheoptimumconditionsofnattokinaseseparation.Methods:therawmaterialswaspreparedfromcrudenattokinaseliquid,byultrafiltrationandchromatographydetermin

4、edthespecificactivity,purificationmultiplesandrecoveryrate.Results:Theoptimizedconditionswereasfollowing:reactionpressure0.25MPa,liquidtemperature37,liquidpH7,thespecificactivity9610.46IU/mg,thepurificationmultiple2.36andtherecoveryrate92.3%,thepurifiedenzymewasdemonstratedbySDS-PAGEtobeahomogeneous

5、protein,molecularmasswasabout28000u.Conclusion:Itisfeasibletoseparateandpurifynattokinasebyusingultrafiltrationtechnology,anditcanelevateactivityandtherecoveryrate.Keywords:nattokinase;ultrafiltration;enzymeactivity;purificationmultiple;recovery纳豆激酶(NK)是纳豆在发酵过程中由纳豆菌产增的具有潜在药用价值的物质。生的一种丝氨酸蛋白酶，可水解纤维蛋白成

6、小肽近年来国内外纳豆激酶分离纯化的相关研究和氨基酸，和蚯蚓纤溶酶、蛇毒纤溶酶一样可直很多，主要有层析法、磁性微球分离法、集成化接溶解血栓1。研究表明，纳豆激酶是一种溶栓效分离技术，包括双水相亲和分配技术、扩张床吸果十分显著，并且能够预防和抑制血栓产生与扩附技术、混合模式扩张床吸附技术等。以上分离收稿日期：2009-08-31*通讯作者基金项目：黑龙江省农垦总局课题(HNKXIV-06-05a)。作者简介：陈景鑫(1982)，女，硕士研究生，研究方向为食品科学。·225·提取物与应用食品科技FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY2010年第35卷第5期方法虽然工艺简

7、单，实验条件容易控制，在纳豆激酶分离纯化中得到了广泛应用，但至今都停留在实验室研究阶段，而且总产率较低，多为间歇操作，生产效率难以提高，从而造成纳豆激酶分离纯化的成本很高，难以实现工业化生产2。超滤是以压差为驱动力的膜分离技术。按照截留分子量的大小，可分离3001000ku的大分子物质。比膜孔小的物质和溶剂一起透过膜，而较大的物质则被截留3。李立民等4通过加入CaCl2和Na2CO3对发酵液进行盐析处理、离心过滤、超滤浓缩、离子交换层析等操作之后，得到了较纯的酶，活力为3528IU/mg，酶回收率为61.74%。但是，结果表明，该方法中的盐析处理降低了酶的活力；另一方面，其利用的超滤只是进行了

8、浓缩，并未达到分离的目的。由于超滤技术在操作过程中无相变化，因此不会改变产品的性能和活性，是一个简单的过程。超滤设备和工艺较其他分离方法简单，耗能低，滤膜可以反复多次使用；处理量大，处理时间短，样品残留小，产品收率高3。因此，本研究将液体深层发酵后的纳豆激酶经过滤、离心处理后，拟直接采用超滤技术对其进行提取，达到分离纯化的目的。但是超滤膜在使用过程中的一个主要问题是由于浓差极化、膜孔堵塞及凝胶层出现等因素的影响，导致膜通量随运行时间的延长而降低，因此本实验重点研究超滤系统的操作压力、料液温度、料液pH值对膜通量的影响，使超滤系统能高效稳定运行，提高产品得率。11.1材料与方法材料发酵第2天产生

9、的发酵液以4000r/min、20min离心分离，得到上清液，再将得到的上清液进行抽滤，可得到滤液。抽滤的目的是防止杂质堵塞滤膜。1.3.2纳豆激酶的膜分离方法将抽滤后得到的纳豆激酶液通过截留分子量为30000u的超滤膜，再将其透过液通过截留分子量为10000u的超滤膜，收集中间分子量段的纳豆激酶滤液。分别采用不同的操作压力、不同料液温度、不同料液pH进行超滤，考察其对超滤膜膜通量的影响并进行方差分析，以确定最佳技术参数。1.3.3膜通量的测定超滤系统运行稳定后，按试验设计控制压力、料液温度、料液pH等操作参数,，取样，记录一定时间内的透过液，重复3次求平均值,，按下式计算膜通量。J=V/T&

10、#215;A式中：J为膜通量，L/m2·h；V为取样体积，L；T为取样时间，h；1.3.4A为有效膜面积。纳豆激酶层析分离为了得到单一分子量的纳豆激酶，将超滤分离后的酶液进行进一步的层析分离，分别考察纳豆激酶在SephadexG-75、SephadexG-50和HPD-400中的分离效果，通过活性测定及分离效果分析，最终确定采用HPD-400做为层析分离的填料。其操作步骤如下：(1)树脂的预处理：称取一定量的树脂，加质量分数为2%的NaOH浸泡过夜，用蒸馏水洗至中性，再加体积分数为95%乙醇浸泡2h，然后用蒸馏水洗至乙醇完全除尽，置于50恒温烘箱中烘干备用。(2)装柱：用玻璃棒搅拌均

11、匀后引流灌入内径1.6cm的柱子中，让树脂自然沉积，打开出水口，待树脂自然沉积完毕后，关闭出水口。灌好后的柱子应表面平整，柱体无气泡，以免影响分离。(3)平衡：灌好的柱子胶面上用洗脱液加满直至进样口，并确保没有气泡进入，然后进行25柱床体积平衡。(4)上样：等洗脱液液面距离胶面2mm时将样液延柱壁缓慢加入，防止加样时将胶面冲起影响分离，上样量1mL。(5)洗脱：上样后待样液进入柱床，并与柱床基本平齐时加入40%体积浓度的乙醇溶液进行洗脱。纳豆激酶发酵液：由实验室纳豆菌发酵制得；凝血酶：中国药品生物制品检定所；纤维蛋白原：北京奥博星生物技术责任有限公司；尿激酶：中国药品生物制品检定所；琼脂糖：台

12、湾MDbio公司；考马斯亮蓝：sigma公司；其他试剂：分析纯。1.2仪器切向超滤装置：PN33349，PALL；超滤泵：7518-00，MASTERFLEX；层析柱：1.6×50cm，上海精科实业有限公司；紫外可见分光光度计-T6新世纪：北京普析通用仪器有限责任公司；台式离心机：北京京立离心机有限公司；SHB-3循环水多用真空泵：郑州杜甫仪器厂。1.3方法1.3.1纳豆激酶粗酶液的制备将经过深层液体··226食品科技2010年第35卷第5期FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY提取物与应用(6)收集：以0.8mL/min的速度进行洗脱，分部响的差异显著

13、性及各因素水平之间的差异显著性。收集，每管收集2mL并对其进行活性及纳豆激酶含量测定。2结果与分析1.3.5纳豆激酶活性的测定纳豆激酶纤溶活力2.1不同操作压力下纳豆激酶料液的膜通量的测定采用纤维蛋白平板法，即依照Astrup6等报准确称取处理后的酶液，将超滤压力分别设道的纤维蛋白平板法，测定方法如下：将琼脂糖、定在0.1、0.15、0.2、0.25、0.3MPa，试验设置5个血纤维蛋白原(Fibrinogen)溶液和凝血酶溶液按一定水平(n=5)，超滤温度根据一般蛋白质的超滤数据比例混合，制成人工血栓平板。取纳豆激酶样品设为37，超滤过程中料液pH7，测定膜通量及点样于平板上，37恒温孵育，

14、测溶解圈直径，纳豆激酶含量，实验结果见表1。根据所得数据绘并以尿激酶作标准品对照绘制标准曲线，以测得制出超滤压力与膜通量及纳豆激酶含量的关系曲纤维蛋白溶解圈面积来表示纳豆激酶的活性。线图，见图1。1.3.6纳豆激酶含量的测定纳豆激酶含量的测602.5定采用考马斯亮蓝法(Braford)7-8，方法如下：取一50定量的纳豆激酶样品，用0.15moL/LNaCl配成1002.0)40)L2·hmL样品溶液。取4支试管，其中一支加入0.15moL/mm/L1.5g(m/(LNaCl溶液1mL(空白对照)，另3支中加入样品1量30/通量mL，然后每支试管加入5mL考马斯亮蓝试剂，立膜20含膜

15、通量1.0KN即混匀，1h内以1号管为空白对照，在波长595nm10NH含量0.5处比色，并通过标准曲线确定纳豆激酶含量。01.3.7数据统计分析方法通过超滤单因素实验，0.10.150.20.250.30压力/MPa确定超滤压力、料液温度、料液pH对膜通量的影图1不同操作压力对膜通量的影响响，采用SAS8.2软件系统，分析各因素对膜通量影在表1超滤压力的因素分析中，F值为276.87，表1超滤压力的方差分析及多重比较压力y1y2y3平均值变异来源SSdfMSF值PrF5%水平0.2552.551.153.052.2处理间1151.484287.87276.980.0001A0.349.548

16、.250.049.2处理内10.393101.0393B0.246.545.047.346.3总变异1161.8814C0.1538.037.039.038.0D0.128.029.027.028.0EP值0.0001，R=0.9911，说明超滤压力对膜通量的量下运行，提高膜分离效率，减少膜污染，确定变化有显著差异，且压力各水平之间也存在显著最佳操作压力为0.25MPa。性差异；由图1可以看出，膜通量随着操作压力的2.2不同料液温度下纳豆激酶料液的膜通量增加先增加后下降，在直线上升阶段，随着压力准确称取处理后的酶液，将超滤温度分别设的增大，膜两侧压差增加，膜通量呈直线迅速上定在20、25、35

17、、40、455个水平(n=5)，超滤升，此时膜通量较小，其流动可近似地看作与膜压力为0.25MPa，料液pH值为7，测定膜通量及纳两侧压差成正比；随着压力的继续增加，膜表面豆激酶含量，实验结果见表2。根据所得数据绘制开始形成凝胶层，随着带到膜面的大分子溶质的出超滤压力与膜通量及纳豆激酶含量的关系曲线增加，凝胶层厚度逐渐增大，此外，高压加速了图，见图2。纳豆激酶酶液中大分子物质在膜孔中的沉积，造在表2料液温度的因素分析中，F值为1096.09，成膜孔减小甚至堵塞，减小了膜的有效面积，所P值0.0001，相关系数R=0.9985，采用SAS统计系以此时膜通量随操作压力的上升呈下降趋势。同统对其进行

18、相关性分析，说明料液温度对膜通量时由图1可看出随着膜通量的增加纳豆激酶含量也的变化有显著差异，且料液温度各水平之间也存相应的增加，当膜通量达最大时，纳豆激酶含量在显著性差异；根据超滤膜产品说明书显示，其也达最大值，因此为了使超滤系统能在较高的通耐受最高温度为50，而纳豆激酶在温度超过45·227·提取物与应用食品科技FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY表2料液温度的方差分析及多重比较2010年第35卷第5期温度/4540352520y164.159.552.527.824.57060膜通量/(L/m2·h)504030201002025y263.758

19、.753.028.123.6y362.560.051.229.025.0平均值63.459.452.228.324.32.01.81.61.41.21.00.80.60.40.20变异来源处理间处理内总变异SS3907.805.76003913.56df41014MS976.950.5760F值1096.09PrF0.00015%水平ABCDE度，结合料液特性与膜材料的特性要求，超滤时的最佳料液温度设定在37。NK含量/(mg/mL)2.3不同料液pH时纳豆激酶料液的膜通量膜通量NH含量3540温度/45准确称取处理后的酶液，将超滤pH分别设定在6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，5个水

20、平(n=5)，超滤压力为0.25MPa，料液温度为37，测定膜通量及纳豆激酶含量，实验结果见表3。根据所得数据绘制出超滤压力与膜通量及纳豆激酶含量的关系曲线图，见图3。4540膜通量/(L/m2·h)35302520151050678pH910膜通量NH含量1.41.21.00.80.60.40.20NK含量/(mg/mL)图2不同温度对膜通量的影响时，酶活性受温度影响较大。因此选择2045为考察范围。由图2表明，膜通量随着料液温度的升高而呈上升趋势，且在超滤过程中，温度高的料液的通量始终大于低温料液，但由纳豆激酶含量曲线可知，在3540之间时纳豆激酶含量最高，当温度超过40时蛋白变

21、性，纳豆激酶含量有所损失；温度过高也会导致超滤膜的老化，影响膜的寿命，还要消耗过多的能量。此外，由液体深层发酵可知，纳豆激酶的最适产酶温度是37，此时酶的活性最高。因此，为了加快超滤速pH876910y141.734.727.820.819.8y240.035.028.121.020.0y341.834.829.021.621.6平均值41.234.828.321.119.5变异来源处理间处理内总变异SS1005.944.36671010.3图3不同料液pH对膜通量的影响表3料液pH的方差分析及多重比较df41014MS251.480.4367F值575.92PrF0.00015%水平ABCD

22、E在表3pH的因素分析中，F值为575.92，P值0.0001，相关系数R=0.9957,采用SAS统计系统对其进行相关性分析，说明料液pH对膜通量的变化有显著差异，且料液pH各水平之间也存在显著性差异；由图3可看出，由于料液中大分子蛋白质含量较多，其膜通量受pH值影响较大，当pH值在67之间时，膜通量较低，这是因为纳豆激酶的等电点在此pH范围内；当pH值为8时，膜通量达最大值；当pH值大于9时，膜通量迅速下降，因为在较强的碱性介质中纳豆激酶发生变性，从而沉积在··228膜表面，降低了膜通量。同时由图中可看出纳豆激酶含量在pH67范围内逐渐增加，当pH为7时，纳豆激酶含量达

23、最大值，因此料液pH值应控制在6.07.0范围内较适宜。实际操作中，发酵液的pH值为7.0，因此直接采用发酵液本身的pH即可。2.4超滤液测得的纳豆激酶层析图谱采用上述实验确定的超滤最佳值进行试验，将得到的酶液过HPD-400色谱柱，得到层析谱图，如图4所示，层析谱图为单一酶峰，料液不同方法处理后的检测结果见表4。食品科技2010年第35卷第5期FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY提取物与应用0.60液pH值为7。0.50经过超滤处理后的酶液过HPD-400色谱柱后，A度0.40其比活力达到9610.46IU/mg，纯化倍数为2.36倍，光吸0.30回收率为92.3%，经电泳检测，

24、得到单一条带，其0.20分子量与纳豆激酶分子量相同，为28000u。0.10由于未采用盐析处理，克服了传统方法中由于盐离子的加入而使酶活性降低的缺点，与李立00:0000:5101:4302:3503:2604:18民先盐析处理，再经过超滤浓缩后得到的纳豆激图4纳豆激酶HPD-400层析图谱酶相比，活性提高了6082.46IU/mg，回收率提高表4料液不同方法处理后的检测结果了30.56%；方法总酶活/总蛋白/比活力/回收(IU/mL)(mg/mL)(IU/mg)纯化倍数率/%超滤法能够有效地除去料液中相对分子质量粗酶液5621241384073.36-100较大和较小的组分，且避免了盐析方法

25、中的高渗超滤5378321055122.211.2695.7作用，减少了酶蛋白的损失，提高了产品中纳豆层析518965549610.462.3692.3激酶的含量及活性。因此，超滤法应用于纳豆激2.5超滤液纳豆激酶纯度鉴定酶的分离提纯是一种效率较高的方法，超滤法具有处理量大，分离效果好和操作简便的特点，此97400u66200u方法的实验结果可为纳豆激酶的大规模生产提供43000u技术支持。31000u参考文献：1ChenHM,GuanAL,MarklandFS.Immunologicalprop20100uertiesofthefibrinolyticenzyme(fibrolase)fromsouihem14400ucopperhead(Agkistrodencontortrixcomortrix)venomanditspuri-ficationbyimm