正畸治疗前后患者口内菌群变化检测与分析

1、研究背景：有报道显示我国儿童与青少年的错牙合畸形患病率为67.82 1。颌面部畸形直接影响到儿童颌面部生长发育、口腔健康、功能和容貌外观以及心理健康。正畸矫治的 病患随着生活水平的增加也逐年增多。正畸固定矫治中，很多患者在矫治过程中会出 现牙齿表面釉质脱矿的现象。有研究显示，牙齿表面釉质在固定正畸矫治过程的脱矿 率大约为 2-97%2, 3 。这些现象可能与正畸矫治器的粘接有关，因为在固定矫治过 程中牙齿上需要粘接托槽、带环等矫治附件，这些附件可能会使牙齿表面清洁受限、 软垢滞留，从而影响口腔健康。但是在临床治疗过程中我们也经常发现，有些正畸固 定矫治的患者虽然在矫治过程中软垢很多、口腔卫生很

2、差，而且矫治时间较长，牙面 也未出现明显的脱矿现象 11 。那么在固定正畸矫治过程中的釉质脱矿的原因是什么 呢？本研究从微生物学方面对正畸患者佩戴矫治器前后进行菌群测定，分析正畸患者 在固定正畸矫治前后口腔菌群的变化及其与口腔健康的关系。研究目的：探讨正畸固定矫治前后患者口内菌群的变化；将患者口腔菌群的变化与患 者口腔健康相联系研究两者之间的相关性。研究方法：从 2013 年 8 月 -2014 患者中随机选取口内牙齿没有明显脱矿患者 20 名，于正畸矫治 前刮取其上颌前牙牙区菌斑，分为未治疗组组；选取正畸治疗超过六个月并且前牙未 出现明显脱矿且口腔健康状况良好患者 20 名，取同样区域菌斑为

3、正畸治疗组。年 8 月 间在山东大学口腔医院正畸科正在进行固定正畸矫治。取牙面菌斑样本，菌斑基因组 DNA 提取后 PCR扩增，最后对扩增子进行测序和分析， 检测正畸前后口内菌群的变化情况。结果：研究结果显示来自正畸治疗组的菌斑多样性与未治疗组没有明显差异（ P>0.05 ）。实 验测得口腔内约有 238 个不同的细菌菌属与维持口腔微生态平衡有关。其中 10 个属的 细菌含量较高，占整个口腔的 70 ，分别是 Parascardovia ，Rothia, Corynebacterium,Leptotrichia, Streptococcus, Selenomonas, Prevotell

4、a, Capnocytophaga,Hylemonella 。通过将正畸前后牙面菌斑比较，我们发现有6 个属的细菌存在差异。 6个属的细菌包括在 Parascardovia, Leptotrichia, Corynebacterium ， Streptococcus ， Selenomonas, 以及 Prevotella 。我们的实验结果表明，正畸治疗前后菌群结构存在一 定的差异性，多种菌属与龋病的发生可能存在正相关或负相关关系，而这种菌属的改 变在临床并未引起相应口腔健康的改变，我们可以认为在正畸治疗以后口腔内微生物 菌群建立了一个新的稳定生物体系。结论：患者戴用固定矫治器后，出现了局部牙

5、面菌斑中Streptococcus, Corynebacterium,Leptotrichia, Antinomycetes, 以及 Lactobacillus 总菌群中含量明显增高的情况。本研 究结果提示，患者戴用正畸固定矫治器后，局部牙面菌斑中的菌群构成发生改变，并 且进入一种新的稳定平衡状态。关键词：固定正畸治疗 16S rDNA 菌属含量前言临床上正畸患者的口腔卫生的保持一直是比较难以维持的。在临床上我们就经常发现 许多固定正畸矫治的患者在矫治过程就发生了牙面脱矿的现象。显然这与牙面菌斑在 固定正畸矫治的附件周围聚集有一定的关系 4, 5 。可能是因为在正畸治疗过程中会出 现口内菌群的

6、紊乱，牙周治病菌以及致龋菌比例增多的现象，从而导致牙周炎以及釉 质脱矿的发生。有研究显示，固定矫治过程中发生釉质脱矿的概率大约为 2-97% 2,3 ，其主要表现为脱矿牙釉质表面光泽度下降呈白垩色，影响美观，严重者可导致龋 的发生 4 。也有调查显示固定矫治器粘接 6 个月内脱矿的发生率明显增加， 6-12 个月 间脱矿发生率也会有所上升 1 。另一方面在临床治疗过程中也经常发现，有些接受正畸固定矫治的患者即使在矫治过 程中软垢很多、口腔卫生很差，同时矫治时间较长，牙面也未出现明显的脱矿现象以 及牙周疾病，在这种情况下口腔内菌群又发生了什么样的变化？本实验使用 16S rDNA 测序的方法，分

7、析口腔菌群在正畸前后发生的变化。16S rRNA位于原核细胞核糖体小亚基上，包括 10 个保守区域和 9 个高变区域，保守区在细菌种 属之间没有很大的差距，而高变区域在细菌种属之间有明显的差异。因此， 16S rDNA 可以做作为分别生物物种的特征核酸序列，已经被广发认为是可以较快且准确分析细 菌系统和分类鉴定的指标。以往 454 测序平台以读长优势广泛应用于 16S rDNA 测序 领域，但是随着 MiSeq 平台双端 PE250 和 PE300 测序策略的发展，读长不断增长，使 得基于 MiSeq 测序研究物种多样性的准确性大幅度提高 7 ，所以已经成为研究微生物 群落多样性的首选之策 8

8、,9 。根据所扩增的 16S 区域特点，基于 Illumina MiSeq 测序 平台，利用双末端测序( Paired-End )的方法， 构建小片段文库进行双末端测序。通 过对 Reads 拼接过滤， OTUs(Operational Taxonomic Units) 聚类，并进行物种注释及 丰度分析，可以揭示样品物种构成；进一步的 多样性分析 (Alpha Diversity) ， 多样性 分析 (Beta Diversity) 可以分析样品之间的差异。本研究从微生物学方面应用 16S rDNA 测序的方法对正畸患者佩戴矫治器前后进行菌群 测定，分析在正畸固定矫治前后患者口内菌群的差异及其

9、影响。材料与方法1. 实验材料1.1 实验试剂1) PBS缓冲液(上海研域试剂有限公司)2）Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix （New England Biolabs 公司）3）GC缓冲液（ New England Biolabs 公司）4) DNA 纯化回收试剂盒 (北京天根生化科技有限公司)5）蓝白斑筛选试剂（上海生工生物工程有限公司）6）胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉（上海生工生物工程有限公司）（7） Eppendorf 管（海门市盛邦实验器材有限公司）1.2 主要仪器设备1）DL CJ IN 型高性能超净工作台 （哈尔滨市东联电子技术公司）2）M

10、LS 3750 型高压灭菌器 （日本 SANYO 公司）3）MDF一382E型超低温冰箱 （日本 SANYO公司）4）TGL_16G 型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）5）ND一 2000C 型微量紫外分光光度计（美国 NanoDrop 公司）6）PowerPac 3000 型Bio rad 电泳仪（美国 BIO RAD公司）7）1 70 4406型小型水平电泳槽（美国 BIO RAD公司 ）8）GelDoc 2000 型凝胶成像系统（美国 BIO RAD公司）9）LightCycler 480 Real Time PCR 仪（瑞士 Roche公司）10 ）微量移液器（德国 Eppendo

11、ff 公司）（11）生物安全柜（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）（12 ）梯度 PCR仪（德国 Biometra 公司）2. 实验方法2.1 研究对象2.1.1 研究对象的选择从 2013 年 8 月 -2014 患者中随机选取口内牙齿没有明显脱矿患者 20 名，于正畸矫治 前刮取其上颌前牙牙区菌斑，分为未治疗组组；选取正畸治疗超过六个月并且前牙未 出现明显脱矿且口腔健康状况良好患者 20 名，取同样区域菌斑为正畸治疗组。每位受试者的共同纳入标准：（1）近期居住在山东地区的汉族人群，有相似的饮食习惯；（2）口腔卫生可，没有明显牙周炎，龋病以及釉质脱矿等口腔疾病；（3）近 1 个月内未使用抗生

12、素、益生菌或益生元等微生态制剂；（4）无其他严重全身疾病及并发症，女性非妊娠期或哺乳期；5）近 1 年内未接受过牙周治疗；6）无吸烟史；（7）年龄在 14 至 28 岁。2.1.2 对研究对象的年龄分布均衡性检验对患者年龄分布均衡性检验经 2 检验结果显示，实验组以及对照组年龄分布具有均衡 性（见表 1 ）表 1 患者年龄均衡性检验（ X+SD, 单位：岁）指标分组 P 值未治疗组正畸组年龄（岁） 19.6+3.31 21+3.28 0.321说明： p 值0.05 ，组间数据结构无显著差异2.2 临床参数和标本收集2.2.1 问卷调查问卷主要包括 （姓名、性别、年龄、民族、联系电话、家庭住址

13、、身高、体重、生活 等） 、全身系统性疾病史、口腔相关信息 （ 是否有刷牙或咬硬物出血、是否有牙齿松动 或咀嚼无力、牙周治疗史、牙周炎家族史 ）。2.2.2 临床检查检查患者口内有无龋坏，有无缺失牙齿。使用 Williams 牙周探针，检查并记录每位受 试者现存牙 （第三磨牙除外 ）的牙周临床指标，包括探诊深度 （PD） 、附着丧失 （AL） 、探诊 出血 （BOP）。所有检查均由同一名医师完成。2.2.3 实验样本收集选取口腔卫生较好的患者作为实验群体，样本采集时间在饭后 2-4 h ，采样前先用清水 鼓漱约 1min ，以除去食物残渣，隔湿、干燥后用无菌探针于患者下颌前磨牙唇颊侧托 槽龈方

14、牙面刮取适量菌斑。置于 2ml 无菌 eppendorf 管（取样前称重并记录其重量， 盛有 PBS转运液），半小时内送至实验室，再次称重取差值得样本质量2.2.4 菌斑 DNA 的分离将存储菌斑标本的缓冲液解冻后，抽提菌斑细菌基因组DNA，具体操作过程如下：1 ）解冻后的存有样本菌斑的缓冲液离心， 15,000rmp 离心十分钟，去除上层清液2）在沉淀中加入裂解液 ATL，上下颠倒使之混匀3）在每管中加入 20L 蛋白酶 K溶液以及锆珠，颠倒使之混匀，在振荡器上振荡 3 次，每次 1min4）振荡完成后，在 56的水浴箱中静置 45min5）于每管中加入 200L 裂解液 AL,混合均匀后置

15、于 70的水浴箱中 40min（6）加入 200L 无水乙醇，混合均匀后加入分离柱中，简短离心。（7）丢弃过滤液，把分离柱放入新的收集管中，用AW1，AW2 清洗两次。（8）最后用 10 L洗脱液洗脱 DNA 两次，提取后的 DNA-20 保存。2.2.5 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯度和浓度1.制备 1%的琼脂糖凝胶，称取 0.4g 的琼脂糖加入 40mlTBE 缓冲液中，微波炉中加热 至琼脂糖完全融化，在室温条件下冷却到 65 左右。2.在琼脂糖中加入 3.0L 锈乙锭贮存液，将其缓慢倒入事先准备好的制胶器中，防止 出现气泡，凝胶的厚度控制在 0.3-0.5mm ，室温下放置至凝胶完全

16、凝固，小心取出梳 子，将制备好的凝胶放入电泳槽内。3. 在电泳槽内加入 TBE 缓冲液至液面刚刚淹没凝胶表面。4. 将制备好的产物与 10 ×上样缓冲液混匀，将其加入到上样孔中，同时在一边加入5.0L 的 DNA 分子 maker 。5. 通电进行电泳，电压 100V 开始电泳，根据指示剂迁移的位置决定是否停止电泳，观 察电泳结果（如图 1）。2.2.6 PCR 扩增取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1ng/ l 。稀释后的基因组 DNA 为模板；根据测序区域的选择，使用带 Barcode 的特异引物；使 用 New England Biolabs 公司的 Phusion?

17、 High-FidelityPCR Master Mix 。引物对应区 域：16S V4区引物为 515F-806R ；18SV4区引物为 528F-706R ；18S V9 区引物为 1380F-1510R ； ITS1 区引物为 ITS1F-ITS2 ；ITS2 区引物为： ITS2-3F-ITS2-4R 。50LPCR 扩增体系为 : DNA 模板量: 1.5 L，dNTP( 200 mol/L):4 L，10×Buffer:5 L, Taq 酶( 5 U/L) :0.25 L， Primer(10 mol/L):2 L，补足 ddH2O至 50L。PCR 反应程序为 :94

18、3min 变性( DNA 双链解离)94 1min 变性65 56 1 min 退火 30 个循环72 1min 延伸72 7min4 10min2.1.3 PCR 产物的混样和纯化根据 PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用2% 的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物 ,结果如(图 2)，因浓度较低进行第二次 PCR，以及 PCR产物检测(图 3，4). 使用 Thermo Scientific 公司的 Gene JET 胶回收试剂盒回收产物。2.1.4 文库构建和上机测序使用 New England Biolabs 公司的 NEB Next? Ultra? DNA Library Prep

19、 Kit for Illumina 建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过 Qubit 定量和文库检测，合格后，使 用 MiSeq 进行上机测序。2.2 信息分析将测得的原始数据进行过滤分析，去除干扰数据（包括接头信息，低质量碱基，未检 测出的碱基等），得到有效数据。然后基于有效数据进行OTUs 聚类和物种分类分析，并将 OTU 和物种注释结合，从而得到每个样品的 OTUs 和分类谱系的基本分析结 果。再对 OTUs 进行丰度、多样性指数等分析，同时对物种注释在各个分类水平上进 行群落结构的统计分析。最后在以上分析的基础上，可以进行一系列的基OTUs、物种组成的聚类分析， PCoA和 PC

20、A、CCA和 RAD 等统计比较分析，挖掘样品之间的物种 组成差异，并结合环境因素进行关联分析。结果1.16SrDNA 测序后所得结果经过 16SrDNA 测序后，一共得到 751,858 条基因序列，经过对原始数据的拼接，过 滤，得到约 710 ，825 条高质量的有效数据，测量结果如表（ 2）。其中正畸前有效数 据为 360 ，632 条，正畸后的有效数据为 350,193 条。平均序列长度为 253bp 。表（ 2）数据产生的统计信息表2. 正畸矫治前后口内牙面菌群的丰度和分类2.1 物种信息的读取数据以及初步分析Effective为了研究样品的物种的组成多样性信息，对所有样品的全部Ta

21、gs 序列聚类，以 97% 和 95% 的一致性 （Identity） 将序列聚类成为 OTUs （Operational Taxonomic Units） 结果。在 OTUs 构建过程中，对不同样品的 Effective Tags 数据，低 频数的 Tags 数据和 Tags 注释数据等信息进行初步统计，统计结果的展示（见图 5）。将两组以 97% 的一致性聚类成为的 OTUs 数目进行方差分析，发现非矫治组与正 畸矫治组的 OTUs 数目没有明显差异（ P>0.05 ）。选取最大相对丰度排名前 10 个属所对应的 OTUs 的系统发生关系数据，并结合每个 OTUs 的相对丰度及其代表

22、序列的物种注释置信度信息，整合结果展示（如图6）所示，可以直观的展示研究环境中的物种组成的多样性。2.2 正畸前后患者口内菌群的丰度和分类2.2.1 样品复杂度分析 （Alpha Diversity）Rarefaction Curve ，即稀释曲线（见图 7） ，是从样品中随机抽取一定测序量的数据， 并且统计这些数据所代表物种数目 （也即是 OTUs 数目） ，以抽取的数据量和所测得的相 应物种数来构建的曲线。所以稀释曲线可以直接反映测序数据量的合理性，并间接反 映样品中物种的丰富程度，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量渐进合理，更多的数 据量只会产生少量新的 OTUs。同时从 Rarefact

23、ion curve 也可以看出每组样品中在在 3非相似度 （cutoff） 上各个组可以得到约 200 种左右的种系。2.2.2 多样品比较分析 （Beta Diversity）Beta 多样性研究中，选用 Weighted Unifrac 距离和 Unweighted Unifrac 两个指标来衡 量两个样品间的相异系数，其值越小，表示这两个样品在物种多样性方面存在的差异 越小。以 Weighted Unifrac 和 Unweighted Unifrac 距离绘制的 Heatmap 展示结果（见 图 8）。我们从图中可以看出 EX1.4，EX1.5，EX1.7，EX1.8，EX2.2,NC

24、1.1 ，NC1.2， NC1.3， NC1.6 ，NC1.7 ， NC1.8 与另一组在物种多样性上差别较大。2.2.3PCA 分析主成分分析 (PCA， Principal Component Analysis) ，是一种应用方差分解，对多维数据 进行降维，从而提取出数据中最主要的元素和结构的方法 26 。PCA 能够提取出最大 程度反映样品间差异的两个坐标轴，从而将多维数据的差异反映在二维坐标图上，进 而揭示复杂数据背景下的简单规律。如果样品的群落组成越相似，则它们在PCA 图中的距离越接近。展示结果见图 92.3 在门水平上进行分类将测序样品的序列进行比对，在生物分类学门的水平进行分析

25、，主要有 10 个门的细菌 发现。它们分别是： Tenericutes ， Synergistetes ， Spirochaetes ，Proteobacteria ， Firmicutes ，Cyanobacteria, ， Bacteroidetes ， Actinobacteria,TM7,Fusobacteria 。其中 有五个门的细菌在其中占主要地位。它们分别是： Actinobacteria ， Firmicutes ， Proteobacteria ， Bacteroidetes 和 Fusobacteria ，并且其中有四个门的细菌在正畸组中 较非正畸组中有明显升高，它们分别是

26、 Firmicutes ， Bacteroidetes ， Actinobacteria, Fusobacteria 。2.4 在属水平上进行分类在属水平进行分类，可以得到 145 个不同的属。其中 10 个属的细菌含量较高，占整个 口腔的 70 ，分别是 Parascardovia ，Antinomycetes, Corynebacterium, Leptotrichia, Streptococcus, Lactobacillus, Prevotella, Capnocytophaga, Hylemonella。通过将正畸前后牙面菌斑比较，我们发现有 5 个属的细菌存在差异。 5 个属的细菌

27、包括在 Streptococcus, Corynebacterium, Leptotrichia, Antinomycetes,以及 Lactobacillus 在正畸组中有明显升高。2.5 在种水平进行分类 两组之间存在着大量相同种的细菌将其中龋病主要致病菌 Streptococcus, Antinomycetes, 以及 Lactobacillus 前后数据提取出来统计分析，分析结果（如图 10 ， 表 3 ）表（ 3）非治疗组与正畸组比较变形链球菌放线菌乳杆菌分组 P值P值 P值非治疗组 P<0.05P<0.05P<0.05 正畸组 P<0.05P<0.05

28、P<0.05说明：未治疗组与正畸治疗组各组相比 P 值均小于 0.05讨论1.关于实验选择牙面的讨论我们在临床可经常发现在固定正畸治疗过程中上前牙区以及上颌磨牙区是最常会出现 釉质脱矿现象。并且有学者统计发现上前牙是在正畸固定矫治过程中最好发生牙釉质 脱矿的牙位 10 ，一般主要发生在牙面的唇颊面牙釉质，主要以托槽边缘处最为明显12 。同时也有国内外很多学者发现上颌牙齿的脱矿率高于下颌牙齿 13 ，并且上颌侧 切牙的脱矿率最高。因此，由于上颌侧切牙的脱矿率最高，可能也相对说明上颌侧切 牙区牙面菌斑的成分改变较明显，故本实验选择上颌侧切牙作为实验的取样牙位。由 于本部分研究的目的是分析固定

29、矫治器戴用后牙面的菌群变化情况，而我们在临床上 观察发现，戴用固定矫治器后虽然有比较高的釉质脱矿发生率，但大部分的患者还是 没有出现釉质脱矿的现象。故我们在研究中选用了在固定矫治过程中没有出现脱矿的 患者做为研究对象，这样可以比较好地反映固定矫治器戴用后牙面菌群变化的一般趋 势。同时本研究的样本量不是很大，如果将发生釉质脱矿的患者也包含在戴用固定矫治器的患者中，与未行正畸治疗的个体进行比较，可能会因为发生脱矿的患者牙面菌 群变化比较大，而对研究结果造成一些偏差。2.正畸固定矫治与口腔健康的相关性在临床中经常可见在固定正畸治疗过程中引起许多口腔健康问题，比如釉质脱矿，牙 龈炎，牙槽骨吸收等等。造

30、成这些口腔疾病的因素很多，但大部分研究认为口腔内菌 群的变化往往是直接作用因素。在正畸固定矫治过程中最常见的口腔疾病之一就是牙 面釉质脱矿。目前很多研究显示，多种致病菌与釉质脱矿相关，其中最主要包括变形 链球菌、乳杆菌、放线菌等 7 。本实验中对正畸矫治前后牙面菌斑的测定，来分析口 腔内菌群的变化，从而得出正畸固定矫治对口内菌群的影响。在一定程度上，固定矫 治过程中釉质脱矿问题的发生，可能与局部牙面菌斑中变形链球菌，放线菌以及乳杆 菌数量的增多有一定相关性。已经有学者的研究 14 中发现固定矫治器戴用三周后， 牙面菌斑中总菌数并没有显著增加，但是变形链球菌比例却有显著性的增高。在正畸 固定矫治

31、中发生的牙面釉质脱矿，与龋病早期的釉质脱矿是相似的，如果这种脱矿问 题得不到控制，进一步发展都可能形成牙面龋损。很多研究也都已经显示出变形链球 菌是龋病发生的主要致病菌。虽然目前研究显示乳杆菌和放线菌不是龋病发生的主要 致病菌，但是这种细菌的增多会使菌部牙面的酸性环境增强，易于釉质脱矿情况发 生。由此可见，本研究显示的固定矫治器戴用后出现的牙面局部菌斑中变形链球菌， 放线菌及乳杆菌，与固定矫治器戴用后易出现釉质脱矿问题是有一定的机制相关性。 这种情况的产生可能与固定正畸矫治器附件粘结后，患者未能充分做好口腔的清洁， 使得牙面软垢附着增多 14 ，继而使致龋菌易于大量聚集有关。有研究显示有釉质脱

32、 矿的牙面其表面变形链球菌的数量多于邻近没有脱矿的牙面 32 。本研究虽然结果显 示固定矫治器戴用后牙面局部菌斑中放线菌及乳杆菌的数目及其在总菌群中所占比例 明显增高，但是牙面并没有出现脱矿的现象。也就是可能在固定矫治过程中，牙面局 部菌斑中菌群的改变能够进入一种矫治过程中的平衡状态。首先我们可以看到，固定 矫治过程中虽然比较容易出现釉质脱矿的现象，但不是每个患者都出现釉质脱矿的问 题。而且我们实验中所选的固定矫治患者就是在矫治过程中没有出现明显釉质脱矿的 患者，而我们的研究结果显示这些患者牙面菌斑中有变形链球菌，放线菌和乳杆菌增 多的情况，说明戴用固定矫治器后，虽然局部牙面菌斑中出现了致病菌增多的情况， 但这并不意味着患者就一定会有