《实验四圆盘电泳》ppt课件

1、 主要过程 凝胶柱的制备凝胶柱的制备加加 样样电电 泳泳剥剥 胶胶固定和染色固定和染色漂洗漂洗滴管灌胶滴管灌胶6%6%别离胶的制备每组四人A液1mlC液2mlH液2mlG液5ml正丁醇 封顶 等待聚合约30分钟3%浓缩胶的制备每组四人B液1mlD液2mlE液1mlF液4ml正丁醇 等待封顶聚合约10分钟本卷须知：本卷须知：丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺C C、D D是是神经毒性神经毒性试剂，并对皮肤有刺激作用，注意防止直接接触。试剂，并对皮肤有刺激作用，注意防止直接接触。大量操作时应在通风橱中进展。大量操作时应在通风橱中进展。用完加盖用完加盖。TEMEDTEMEDA A、B

2、B要密封保存，要密封保存，用完加盖用完加盖。过硫酸铵过硫酸铵G G溶液最好新颖配制，以防止氧化失溶液最好新颖配制，以防止氧化失效。效。用完加盖用完加盖。核黄素核黄素E E需避光保存。需避光保存。构造、原理、电流及电极的方向、不漏水、除气泡构造、原理、电流及电极的方向、不漏水、除气泡电泳浓缩胶时电泳浓缩胶时3mA/管，别离胶时管，别离胶时2mA/管，距底管，距底1cm时止时止实验分组实验分组每人做一管，每每人做一管，每4 4人配一份胶人配一份胶认清试剂认清试剂试剂和吸管对号、量器的使用试剂和吸管对号、量器的使用封管封管别离胶配制与灌胶别离胶配制与灌胶浓度为浓度为6%6%，每组总体积为，每组总体积

3、为1010mlml，灌胶高度为灌胶高度为7878cmcm封正丁醇封正丁醇手法、高度、观察界面变化和判断凝固、时间掌握手法、高度、观察界面变化和判断凝固、时间掌握1515minmin浓缩胶配制浓缩胶配制浓度为浓度为3%，光聚合，每组总体积为，光聚合，每组总体积为8ml，灌胶高度为灌胶高度为1.5cm,留留1cm空加样空加样倒掉正丁醇倒掉正丁醇灌浓缩胶灌浓缩胶封正丁醇封正丁醇观察界面，判断凝固时间观察界面，判断凝固时间安装电泳槽安装电泳槽构造、原理、电流及电极的方向、构造、原理、电流及电极的方向、不漏水、除气泡不漏水、除气泡样品处理并加样样品处理并加样2020ulul 加加bufferbuffer

4、 电泳电泳浓缩胶时3 3mA/mA/管，别离胶时2 2mA/mA/管，距底1 1cmcm时停顿剥剥 胶胶一一电泳的根本原理及相关知识电泳的根本原理及相关知识带电粒子胶体颗粒、离子等在带电粒子胶体颗粒、离子等在电场的作用下在特定的介质中向与其电电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。荷性质相反的电极方向定向泳动的现象。广泛应用于生物大分子的别离和鉴定广泛应用于生物大分子的别离和鉴定主要利用分子之间的两个方面的差异来别离：主要利用分子之间的两个方面的差异来别离：蛋白质两性解离与等电点蛋白质两性解离与等电点溶液溶液pH与蛋白质与蛋白质PI决定蛋白质决定蛋白质电荷性质与数

5、量电荷性质与数量不同蛋白质分子大小和分子形状不同蛋白质分子大小和分子形状的差异的差异纸电泳纸电泳醋酸纤维膜电泳醋酸纤维膜电泳凝胶电泳凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳带电粒子的性质带电粒子的性质电场强度电场强度溶液的溶液的pH溶液的离子强度溶液的离子强度电渗现象电渗现象环境因素环境因素二、聚丙烯酰胺凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 丙烯酰胺丙烯酰胺AcrN，N-亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺Bis自由调节孔径；韧性好；性质稳定；自由调节孔径；韧性好；性质稳定；无电渗作用；无色透明。无电渗作用；无色透明。过硫酸铵过硫酸铵AP四甲基乙二胺四甲基乙二胺TEMED

6、核黄素核黄素四甲基乙二胺四甲基乙二胺TEMED不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个不连续的三个不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳的三个效应的三个效应 凝胶孔径不同凝胶孔径不同缓冲液缓冲液pH不同不同缓冲液离子成分不同缓冲液离子成分不同浓缩效应浓缩效应电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应Gly-Pro-Cl-Gly-Pro-Cl-Cl-Cl-Cl-Pro-Pro-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Cl-Cl-Cl-Pro-Pro-Pro-浓缩效应可显著进步电泳的分辨率浓缩效应可显著进步电泳的分辨率由较低浓度的丙烯酰胺构成由较低浓度的丙烯酰胺构成;

7、;浓缩胶处于别离胶的顶部，因此样品在进入别离浓缩胶处于别离胶的顶部，因此样品在进入别离胶之前首先要经过浓缩胶胶之前首先要经过浓缩胶; ;当样品经过浓缩胶时由于胶内网孔较别离胶网孔当样品经过浓缩胶时由于胶内网孔较别离胶网孔大，样品的挪动速度较快，最终使样品大，样品的挪动速度较快，最终使样品“堆积堆积在浓缩胶和别离胶之间在浓缩胶和别离胶之间. .浓缩胶还具有比别离胶更低的浓缩胶还具有比别离胶更低的pHpH 浓缩胶内的缓冲溶液是浓缩胶内的缓冲溶液是Tris-HClTris-HClpH 6.7pH 6.7, ,该该pHpH远低于远低于TrisTris的的pKpK值值8.18.1。 别离胶内的缓冲溶液是

8、别离胶内的缓冲溶液是pH 8.9pH 8.9的的Tris-HClTris-HCl， 电泳正负两极的缓冲溶液均为电泳正负两极的缓冲溶液均为pH 8.3pH 8.3的的Tris-Tris-甘氨酸缓冲甘氨酸缓冲溶液。溶液。在浓缩胶中，分子量小，且带有大量负电荷的在浓缩胶中，分子量小，且带有大量负电荷的Cl-Cl-在凝胶中在凝胶中的挪动速率较快，而电荷较少且分子量较大的的挪动速率较快，而电荷较少且分子量较大的甘氨酸甘氨酸的挪动的挪动速率较慢。由于二者在同一电场中，具有一样的电流，由此速率较慢。由于二者在同一电场中，具有一样的电流，由此形成的电压梯度导致甘氨酸离子始终跟随在形成的电压梯度导致甘氨酸离子始

9、终跟随在Cl-Cl-的后面，带的后面，带有负电荷的有负电荷的蛋白质样品蛋白质样品那么浓缩在甘氨酸离子和那么浓缩在甘氨酸离子和Cl-Cl-之间向之间向正极挪动。正极挪动。当样品当样品进入进入pH 8.9pH 8.9的别离胶的别离胶时，甘氨酸的解离度增加，在电时，甘氨酸的解离度增加，在电场中的迁移率高于样品，蛋白质不再夹于两种离子之间向正场中的迁移率高于样品，蛋白质不再夹于两种离子之间向正极挪动，这时的蛋白质依靠极挪动，这时的蛋白质依靠分子筛效应分子筛效应和和电荷效应电荷效应进展别离。进展别离。蛋白质所带蛋白质所带静电荷静电荷：在不同的：在不同的pHpH条件下蛋白质所带电荷不条件下蛋白质所带电荷不

10、同。在一定的电场条件下蛋白质将向与其所带电荷相反的同。在一定的电场条件下蛋白质将向与其所带电荷相反的电极方向挪动，挪动速率取决于蛋白质外表电荷的数量，电极方向挪动，挪动速率取决于蛋白质外表电荷的数量，电压越强或电荷越多那么蛋白质挪动的越远。电压越强或电荷越多那么蛋白质挪动的越远。蛋白质的蛋白质的形状和大小形状和大小：蛋白质在电泳中所受的阻力主要取：蛋白质在电泳中所受的阻力主要取决于样品的大小与凝胶网孔大小之间的关系。蛋白质分子决于样品的大小与凝胶网孔大小之间的关系。蛋白质分子越小或凝胶网孔越大，所别离样品所受阻力就愈小，那么越小或凝胶网孔越大，所别离样品所受阻力就愈小，那么在电场中的迁移率就越

11、大。在非变性电泳中，天然蛋白质在电场中的迁移率就越大。在非变性电泳中，天然蛋白质的别离就是蛋白质所带电荷、分子大小及分子形状等因素的别离就是蛋白质所带电荷、分子大小及分子形状等因素共同影响，作用的结果。共同影响，作用的结果。三、实验结果的分析三、实验结果的分析 紫外吸收测定蛋白质含量利用经历公式直接计算样本蛋白质含量利用经历公式直接计算样本蛋白质含量P130P130 器材器材 UV-752 UV-752型紫外分光光度计型紫外分光光度计 试剂试剂 一一 蒸馏水蒸馏水 二二 清蛋白清蛋白人或牛人或牛纯晶纯晶 三三 待测样本蛋白质待测样本蛋白质操作步骤用水稀释蛋白质样本，稀释用水稀释蛋白质样本，稀释

12、1-31-3倍，在倍，在280nm280nm和和260nm260nm两处波长分两处波长分别测得光密度值、再按以下公式计算。别测得光密度值、再按以下公式计算。 1 1、OD280OD2800D2600D2601.51.5时，用时，用Lowry-KalokarLowry-Kalokar公式：公式： 样本蛋白质含量样本蛋白质含量mgmgm1m1 1.51.5OD280OD2800.750.75OD260OD2602 2、OD280OD280OD260OD2601.51.5时，用时，用Lamber-BeerLamber-Beer定律计算：定律计算： 样本蛋白质含量样本蛋白质含量mgmgm1m1 = OD280 = OD280K KL LOD280OD2806.36.31 110g10gL L 本实验样品：牛血清白蛋白本实验样品：牛血清白蛋白E E1%1%cmcm6.36.3100ml100mlcm.gcm.g K K：克分子消光系数；：克分子消光系数；E E1%1%cmcm：百分比吸光度的吸光系数；：百分比吸光度的吸光系数； L L：溶液厚度：溶液厚度标准曲线【方法评价】操作简便、样品溶液可回收，同时可估计核酸含量。操作简便、样品溶液可回收，同时可估计核酸含量。但核酸含量小于但核酸含量小于2020或溶液混浊、那么测定结果误差或溶液混浊、那么测定结果误差较大。较大。公式计算时也应注意各种