HBV前C区和BCP区突变与慢性乙肝病情的关系

1、HBV前C区和BCP区突变与慢性乙肝病情的关系翁彭剑 高国生 丁世雄 梁晓岳 唐向荣【关键词】 乙型肝炎病毒；前C区；核心启动子区；突变；基因芯片The influence of the pre-core and BCP mutations on the severity of chronic hepatitis B WENG Peng-jian, GAO Guo-sheng, DING Shi-xiong, LIANG Xiao-yue, TANG Xiang-rong.【Key words】HBV；PreC；BCP；mutation；microamrray【First authors ad

2、dress】 Ningbo Hospital of Liver Diseases , Ningbo, Zhejiang, 315010, China 乙型肝炎病毒（HBV）是一个双链DNA病毒。HBV感染能导致急、慢性的肝病，其中全球慢性乙型肝炎（CHB）患者超过3.6亿。每年由于HBV慢性感染引起的肝硬化，肝细胞癌死亡患者超过47万人1。而由于HBV病毒的复制过程缺乏校对机制，在慢性感染的过程中发生基因突变的几率很高，相关研究最多的HBV突变株主要有：一是发生在翻译水平的前C突变（G1896A）；二是发生在核心启动子区（BCP区），即A1762T和G1764A的联合突变；三是发生在HBV D

3、NA聚合酶（反转录酶）区的变异包括P区528、552位点的突变。研究表明，HBV前C区1896位突变以及BCP区突变普遍存在于慢性乙型肝炎（CHB）患者中，且随临床病情加重突变感染率逐渐增加，诱导肝脏炎症活动和肝损害，从而使肝纤维化程度呈加重趋势。现采用基因芯片技术对HBV病毒前C区和BCP区突变与慢性乙型肝炎病情的关系进行了较为系统的临床研究。材料与方法11 样本来源：收集2003年1月2005年4月宁波市肝病医院收治慢性乙肝患者HBV DNA阳性血清标本，30保存。（滴度103109拷贝/ml，HBV DNA荧光定量试剂盒为达安公司产品，使用Roche LightCycle荧光定量PCR仪

4、）。 基金项目：中国科学院知识创新工程（KSCX06）作者单位：315016 浙江省宁波市肝病医院检验科（翁彭剑、高国生、丁世雄、梁晓岳）；中国科学院上海微系统与信息技术研究所（唐向荣）其中男性患者238例，女性患者110例；年龄1665岁，平均年龄（41±6）岁；大三阳患者212例，小三阳患者136例（详见表一）。348乙肝患者中，肝癌9例，肝硬化74例，慢性乙肝标本中有54例慢性重度乙型肝炎，140例中度乙型肝炎，53例轻度乙型肝炎，无症状携带者18例。病情诊断标准依据2000年病毒性肝炎防治方案。表一 患者信息例数性别（男/女）年龄均值（范围）HBV DNA均值(范围)HbeA

5、g/HbeAg无症状HBV携带者1811/729.3（±11.3）4.6×104（1.2×1035.6×106）5/13慢性乙型肝炎轻 度5341/1233.1（±8.1）1.3×105（1.2×1032.5×106）35/18*中 度14093/4739.2（±11.2）2.5×107（3.6×1049.6×109）109/31*重 度5439/1546.4（±13.6）1.7×107（2.6×1031.6×109）24/30*乙肝肝

6、硬化7447/2749.7（±16.2）2.3×105（5.6×1034.6×106）33/41*肝癌97/254.3（±15.4）5.6×104（1.2×1033.8×106）5/4*SPSS软件分析卡方分析，与ASC患者HbeAg比例差异显著，P<0.0512检测方法： （1）血清HBV DNA的抽提和扩增 蛋白酶K烈解，酚、氯仿抽提，酒精沉淀。引物设计参考HBV全基因序列（AB014366），NestedPCR扩增包括前C1896位及1762、1764位的前C片段，产物长度分别为325bp、239bp，

7、正向外引物为C1（5-ACG ACC GAC CTT GAG GCA TAC TTC-3，nt1691-1714），反向为C2（5-CAG AGC AGA GGC GGT GTC G-3，nt1998-2016）；正向内引物为C3（5-GAG TTG GGG GAG GAG ATT AGG TTA-3，nt1741-1765），反向为C4（5-Dig-AGG AAA GAA GTC AGA AGG CAA AAA-3，nt1957-1980），反向引物C4 5端带有地高辛标记，用于芯片杂交显色。引物合成及修饰委托TaKaRa公司完成，PCR系统含10×缓冲液1.5µl,Ta

8、q酶1U，25mmol/LMgCl20.8µl、25mmol/LdNTP1µl，上下游引物各0.5µl，引物终浓度为0.5pmol/L，血清提取物1.5µl加双蒸水至15ul，以上 PCR试剂均购自TaKaRa公司。两次扩增条件均为：94 4min变性后，94 30sec，54 30sec，72，30sec，35个循环，72 4min，PCR仪使用MJ100。（2）基因芯片制作：根据HBV 基因组序列分别设计1896，1762、1764各型探针（TaKaRa合成），采用Cartesian点样仪点制阵列如图1： 图1 芯片点阵示意图A1：1896野生型 B

9、1：1896 GA 突变A2：1762野生型 B2：1762 AT 突变A3：1764野生型 B3：1764 GA 突变各位点探针序列如下：1896野生型：NH2-poly(T)16-tgg ctt tgg g(a/g)c atg g1896突变型：NH2-poly(T)16-tgg ctt tag ggc atg ga NH2-poly(T)16-gtg gct tta gga cat gga c1762、1764野生型：NH2-poly(T)16- tag gtt aaa ggt ctt tgt act agg1762突变型：NH2-poly(T)16- tag gtt aat gat c

10、tt tgt act agg a1764突变型：NH2-poly(T)16- gag att agg tta aag at(c/t) ttt gta cta g NH2-poly(T)16- tag gtt aat gat ctt tgt act agg a（3）基因芯片杂交检测 取二次PCR扩增产物（3端带有地高辛标记），98变性后杂交于含HBV各型探针的芯片上，42 30min。杂交体系使用Roche Hybeazy，杂交后使用Roche配套的碱性磷酸酶标记抗体及显色体系进行显色，并转印于尼龙膜（Roche）上，Epson 1640光学扫描仪观察结果2。（4）DNA序列分析 第二次PCR产

11、物由博亚生物技术有限公司采用ABI3730测序仪进行，测序引物为C4，序列比对分析采用DNASTAR软件。14数据统计：采用SSPS10.0软件包处理，采用两个独立样本检验方法进行X2检测，比较不同病情肝炎患者感染HBV病毒基因突变差异。结 果21前C区、BCP区突变及联合突变与乙型病情肝炎的相关性基因芯片对各位点突变检测结果图例见图2：图2 基因芯片膜显色结果1896野生型，1762、1764联合突变 1896突变型，1762、1764野生型348乙肝患者中，肝癌9例，肝硬化74例，慢性乙肝标本中有54例慢性重度乙型肝炎，140例中度乙型肝炎，53例轻度乙型肝炎，无症状携带者18例，见表2：

12、 表2 前C区、BCP区突变及联合突变与乙肝病情关系前C突变BCP突变合计（前C和或BCP）例数突变（）突变（）突变数（）无症状HBV携带者180(0)1(5.6)1(5.6)慢性乙型肝炎167(67.6)轻 度536（11.3）17（32.1）21(39.6)*中 度14039（27.9）*85（60.7）*100(71.4) *重 度5420（37.0）*38（70.4）*46(85.2) *乙肝肝硬化7422（29.7）*56（75.7）*61(82.4) *肝癌94（44.4）*9（100）* *9(100.0) * P0.05, * P0.01采用SPSS10.0软件进行两个独立样本

13、卡方检验（2 independent samples test），两两比较不同病情肝炎与ASC之间，以及不同肝炎病情较轻度慢性乙肝之间前C、BCP突变比例的差异。前C突变BCP突变合计（前C和或BCP）无症状HBV携带者慢性乙型肝炎轻 度X21，P=0.31X23.68，P=0.06X27.26，P=0.01慢性乙型肝炎中 度X25.26，P=0.02X219.52，P=0.00X229.94，P=0.00慢性乙型肝炎重 度X27.46，P=0.01X222.84，P=0.00X237.75，P=0.00乙肝肝硬化X25.49，P=0.02X230.19，P=0.00X238.85，P=0.0

14、0肝癌X27.521，P=0.01X211.64，P=0.00X211.64，P=0.00前C突变BCP突变合计（前C和或BCP）慢性乙型肝炎轻 度慢性乙型肝炎中 度X25.92，P=0.01X212.62，P=0.00X216.62，P=0.00慢性乙型肝炎重 度X29.61，P=0.00X215.71，P=0.00X223.76，P=0.00乙肝肝硬化X26.09，P=0.01X224.02，P=0.00X224.72，P=0.00肝癌X24.03，P=0.04X211.91，P=0.00X211.91，P=0.00在无症状携带者（ASC），以及慢性乙肝轻度、中度、重度患者中，前C突变率依

15、次为0，11.3,27.9,37.0,而在无症状携带者，以及慢性乙肝轻度、中度、重度患者中BCP突变率依次为5.6，32.1,60.7,70.4。在74例HCC（肝硬化）样本中前C、BCP的突变率为29.7,75.7；而在9例肝癌样本中前C、BCP的突变率为44.43,100。采用SPSS10.0软件进行两个独立样本卡方检验（2 independent samples test），两两比较不同病情肝炎与ASC之间，以及不同肝炎病情较轻度慢性乙肝之间前C、BCP突变比例的差异。从统计结果分析，慢性中度乙肝中前C突变、BCP突变情况与病情极为相关，这些数据表明随着随着病毒前C、BCP区突变增加，乙

16、肝患者的病情明显加重。与无症状HBV携带者、轻度乙型肝炎样本中前C、BCP突变情况相比，在一些列病情严重的样本中（包括肝癌、肝硬化、慢性重度肝炎）前C、BCP突变比例有显著的差异，BCP突变比例更有极显著的差异。在136例小三阳患者中前C突变有56例（40.9）, 212例大三阳患者中前C突变35例（16.5）（X225.64， P<0.01）；同时在小三阳患者中BCP突变99例（72.2%）；而在大三阳患者中，BCP突变107例(50.7)（X215.89，P<0.01）。这亦表明小三阳患者中前C、BCP突变比例显著高于大三阳患者。22 随机挑取了50例样本，委托上海博亚对其二次

17、PCR产物进行了DNA序列分析，并和芯片结果进行比较。由表3可见，用基因芯片检测与测序的方法结果基本一致(97/100)，有2例经芯片检测为前C位点野生、突变共存样本在测序分析时分别被归为野生型和突变型，另有一例经芯片检测为BCP位点野生突变共存的情况在测序中被判为突变型。对这三例样本进一步进行PCR产物克隆分析，将PCR产物插入T载体后，转化大肠杆菌，在随机挑取单克隆进行芯片检测鉴定，发现由这三个PCR产物得到的单克隆既有突变亦有野生克隆，证明这些样本确是野生型、突变型病毒共存。与测序相比基因芯片更适于检测野生、突变共存的HBV样本。 表3 基因芯片与测序比对结果前C位点检测结果BCP位点检

18、测结果野生突变共存野生突变共存芯片检测377614333核酸测序388414342讨 论Hadziyannis et al 2001年报道， HBeAg阴性慢性乙型肝炎（CHB） 38%存在前C终止密码子，42%有BCP突变，前C/BCP同时突变占12%3。前C/BCP同时突变易造成慢性乙肝重型化或迅速进展为活动性肝硬化。Shuang-Yuan Kuang 在泰国的研究发现在HBV引起的肿瘤患者89.5（17/19）发现有BCP 1762/1764联合突变。4Yotsuyanagi et al也报道报道BCP区双突变与慢性乙型肝炎病情进展密切相关。5在我国，国内学

19、者方钟燎、庄辉、王佑春等研究结果也发现乙肝病毒核心基因启动子联合突变在肝癌患者中较常见，肝炎患者次之，无症状携带者居最后，6但因为所统计临床样本有限，也有不同观点。为此我们进行了较大规模的临床研究，我们的结果再一次肯定了HBV前C、BCP突变与肝炎病情极为相关，随着乙肝患者病情加重，前C、BCP区突变比例迅速增加，特别是在肝硬化和肝癌患者中，HBV病毒BCP区突变比例分别为75.7%和100。这些都表明检测BCP区联合突变对于预测肝硬化的发展有重要意义。最近，Shuang-Yun Kuang等在PNAS (March 9,2004 vol. 101 3575-3580)上报道一项在我国江苏启东

20、地区进行的一项研究，发现在乙肝病毒引起的肝硬化患者中BCP 1762/1764 的联合突变比例高达74.3，并且发现在具有BCP 1762/1764 的联合突变的15例患者中有8人成为肝癌患者，比例为55。据此Shuang-Yun Kuang推荐，在患者血浆中检测HBV BCP 1762/1764 的联合突变可以作为HCC早期诊断的生物标记7。Shuang-Yun Kuang等在研究中运用质谱结合HPLC进行BCP区PCR产物突变分析，与之相比，基因芯片无论在操作和成本方面均有较大优势，更具临床推广价值。BCP突变、前C1896+BCP突变与慢乙肝病情轻重相关，由于HBeAg阴性或表达水平大大

21、降低，具有使疾病加重和促使向肝硬化、原发性肝癌方向发展的倾向，因此对乙肝患者及时进行前C区1896位与BCP区1762/1764位突变的检测，对于预测病变的转归和预后有重要临床意义。参考文献1 De Ffranchis R, Hadengue A, Lau G, Lavanchy D, et al. EASL International consensus conference on hepatitis B. J Hepatol 2003;39(Suppl 1):S3-252 Ma D，Wang HM，Zhao JL，et al. Application of enzyme coloratio

22、n with digoxin-labeled primers for detection of HBV gene polymorphism. Linchuang Jianyan Zazhi，2004，22（6）：408-411马达，王惠民，赵建龙等. 地高辛标记引物酶显色法检测HBV基因多态性及应用. 临床建议杂志，2004，22（6）：408-4113 Hadziyannis  SJ, Vassilopoulos D. Hepatitis B e antigen-negative chronic hepatitis B.Hepatology,2001,34:617-6244 Kua

23、ng SY, Lekawanvijit S, Maneekarn N et al. Hepatitis B 1762T/1764A Mutations, Hepatitis C Infection, and Codon 249 p53 Mutations in Hepatocellular Carcinomas from Thailand，Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention Vol. 14, 380-384, February 20055 Yotsuyanagi H, Hino K, Tomita E et al. Hepatitis

24、 B virus DNA levels and progressive liver injury in chronic hepatitis B. J Hepatology，2002，37:355-3636 Fang ZHL, Zhuang H, Wang YC, et al. Sequence analysis of precore and core promoter of HBV isolated from patients with liver cirrhosis. Linchuang Gandanbing Zazhi ，2003（03）：183184方钟燎，庄辉，王佑春等. 乙肝肝硬化患

25、者HBV 前C 区和基本核心基因启动子序列分析，临床肝胆病杂志，2003（03）：1831847 Kuang SY, Jackson PE, Wang JB et al. Specific mutations of hepatitis B virus in plasma predict liver cancer development .PNAS,2004,101(10):3575-3580图1：图1 芯片点阵示意图A1：1896野生型 B1：1896 GA 突变A2：1762野生型 B2：1762 AT 突变A3：1764野生型 B3：1764 GA 突变图2：图2 基因芯片膜显色结果1896野生型，1762、1764联合突变 1896突变型，1762、1764野生型表1 患者信息例数性别（男/女）年龄均值（范围）HBV DNA均值(范围)HbeAg/HbeAg无症状HBV携带者1811/731.3（±7.3）4.6×104（1.2×1035.6×106）5/13慢性乙型肝炎轻 度5341/1233.1（±8.1）