利用cDNA-AFLP技术获得小麦耐盐性相关基因TaVHA-C

1、利用cDNA-AFLP技术获得小麦耐盐性相关基因TaVHA-C秘彩莉1,2，张学勇1，温小杰1，刘 旭1（1中国农业科学院作物科学研究所/农业部作物品种资源与生物技术重点实验室，北京100081； 2河北师范大学生命科学学院，石家庄 050016）摘要：【目的】利用cDNA-AFLP技术对耐盐性受主效基因控制的小麦品系98-160盐胁迫前后基因表达的变化进行分析。【方法】对112个克隆的cDNA差异表达片段进行了Blast-x分析。【结果】约有65.2%的片段与已知基因有较高的同源性，从中筛选出18个与小麦耐盐性密切相关的片段，主要包括转录因子、与离子转运有关的蛋白、信号传导相关蛋白、胁迫相关

2、蛋白以及与蛋白-蛋白相互作用有关的蛋白。以94号片段为基础，通过电子延伸和RT-PCR，克隆了小麦液泡膜ATPase亚基（TaVHA-C）的全长cDNA，Northern结果表明，在胁迫的早期（02 h）TaVHA-C基因的表达基本不变，随着胁迫时间的延长（612 h），TaVHA-C基因的表达逐渐减弱，以后（2472 h）又逐渐增强。低温对TaVHA-C基因的表达有明显的抑制作用。【结论】利用cDNA-AFLP技术分离差异表达片段进行相关基因的研究是可行的。关键词：小麦；耐盐性；cDNA-AFLP；TaVHA-CIsolation of TaVHA-C, A Gene in Wheat Re

3、lated to Salt-Tolerance via cDNA-AFLPBEI Cai-li1,2, ZHANG Xue-yong1, WEN Xiao-jie1, LIU Xu1(1Crop Science Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Crop Germplasm Resources and Biotechnology, Ministry of Agriculture, Beijing 100081; 2 Life Science Academy of Hebei Norma

4、l University, Shijiazhuang 050016 )Abstract: 【Objective】 98-160 is a wheat line with excellent salt-tolerance that is controlled by major genes. The expression profiles of 98-160 stressed by salt for different times were studied via cDNA-AFLP.【Method】 One hundred and twelve differentially expressing

5、 cDNA fragments were obtained, which were sequenced and analyzed by Blast-x. 【Result】 One hundred and twelve fragments were cloned and sequenced. The Blastx analysis showed that 62.5% of the sequenced fragments were similar to known genes in the database, in which 18 cDNA were tightly related to whe

6、at salt tolerance, most of them were transcription factor, transportation related protein, signal transduction related protein and proteins related to other stresses. Some fragments encoded proteins involved in protein-protein interaction. Based on a cDNA fragment similar to vacular ATPase C subunit

7、, full-length cDNA of a vacular ATPase C subunit in wheat (TaVHA-C) was obtained using electric PCR and RT-PCR. Northern blot analysis indicated that drought and salt stress had a similar effect on the expression of TaVHA-C. The expression of TaVHA-C was steady at the early stage of stress (0 to 2 h

8、ours), it decreased subsequently (6 to 12 hours) and increased in the end ( 24 to 72 hours). Significant inhibition was observed of low temperature on the expression of TaVHA-C. 【Conclusion】These results further proved that it was viable to isolate genes of plants with large genome size via cDNA-AFL

9、P .Key words: Wheat; Salt tolerance; cDNA-AFLP; TaVHA-C0引言【本研究的重要意义】土壤盐渍化严重影响植物的生长，提高作物的耐盐性对提高作物产量具有非常重要的意义。但耐盐性是一个非常复杂的性状，长期以来人们对植物耐盐性的了解主要来自于生理学的研究成果，如有机溶质的积累1，盐诱导蛋白的产生等2。【前人研究进展】H+-ATPase存在于动植物细胞的质膜和各种内膜系统中，在建立跨液泡膜质子梯度、促进液泡Na+区域化、提高植物耐盐性方面发挥着重要作用3。从功能角度可将H+-ATPase分为两类：利用跨膜的质子电化学势合成ATP，如F型H+-ATPas

10、e；利用水解ATP产生的能量，形成跨膜的质子电化学势，如P型和V型H+-ATPase。V-ATPase存在于所有已知真核生物中，是空泡膜系统中最重要的致电性质子 泵4，全酶由两部分组成，膜的外周部分是一个“头-柄”状结构，为V1部分，与膜整合的部分为V0部分。V1部分由8个亚基（A-H）组成，负责ATP的水解；V0部分由5个亚基（c、c'、c''、a和d）组成，负责质子的运输。许多研究结果表明，在盐胁迫和冷害条件下，V型H+-ATPase通过调节自身结构以适应环境变化，其活性也发生相应的变化，当土壤中存在高盐、干旱和重金属等胁迫时，细胞的存活主要依赖V型H+-ATPas

11、e活性的维持和调整5。在盐生植物碱蓬中，其抗盐的主要策略是增强V-ATPase的表达活性，从而为通过液泡膜进行离子转运提供必要的能量，而且V-ATPase活性的增加不是通过结构的变化，而是通过增加蛋白的表达量来实现的6。V-ATPase中的V-ATPases C亚基是亲水性亚基，位于VHA柄部，与V-ATPases C亚基V1部分的装配/解离关系密切。V-ATPases C亚基在细胞中的作用可能是作为一种锚定蛋白调节V-ATPases与肌动蛋白的联结7。【本研究的切入点】长期以来人们对小麦耐盐机理知之甚少，原因是小麦是异源六倍体，遗传背景较为复杂，因此研究小麦耐盐特性的捷径之一便是从基因表达的

12、差异入手，寻找与小麦耐盐性相关的基因或cDNA片段。【拟解决的关键问题】本研究从基因的差异表达入手，利用cDNA- AFLP研究盐胁迫前后基因表达的变化，以发现与小麦耐盐性密切相关的cDNA片段，以此为基础，克隆小麦液泡膜ATPase C subunit（TaVHA-C）基因的全长cDNA。1材料与方法1.1材料以耐盐性受主效基因控制的小麦品系98-1608为材料。将98-160的种子浸泡过夜，然后转入铺有滤纸的培养皿中，待幼苗长至5 cm时，转入Hoagland营养液中培养。当幼苗长至两叶一心时，加入1.5% NaCl进行盐胁迫，整个培养过程在25进行。胁迫时间分别为0、15 min、2 h

13、、6 h、12 h、24 h和72 h。1.2cDNA-AFLP分别提取7个处理的小麦样品根的总RNA（Trizol，Invitrogen），cDNA的合成按Takara的cDNA synthesis kit（M-MLV version）操作说明进行。合成的双链cDNA经PstI/MseI双酶切并加接头进行预扩增，将预扩产物稀释100倍作为模板，以P/M引物组合进行选择性扩增。选扩产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上进行分离和银染。切取差异表达片段，用原引物进行二次扩增。PCR产物用Promega公司的T-easy载体进行连接和克隆。鉴定出的阳性克隆提取质粒后在DNA Analyzer 3730 XL上

14、进行测序，测序结果在http:gov/blast网站上进行Blast-x比对。1.3 小麦TaVHA-C全长cDNA克隆和表达将液泡ATPase C亚基片段转换成FASTA格式提交NCBI网站的electric PCR系统进行电子延伸。根据电子延伸的结果设计扩增TaVHA-C全长cDNA的引物，序列如下：V-ATPase 5-2: 5 gACCTCCTCCTCCCgCTCCCC CTCg 3；V-ATPase 3-1: 5 AAAAAgTAAACAgTTgTAACA gCgTAgC 3。98-160盐胁迫2 h后根的总RNA的提取以及cDNA合成按前述方法进行。按如下程序进行PCR：94 5

15、min，（94 30 s，60.5 40 s，72 2.5 min）×32，72 10 min。扩增产物克隆到Promega公司的pGEM-T easy vector上进行测序验证。分别提取98-160盐（1.5%NaCl）、干旱（16.7% PEG）以及低温（4）胁迫0、15 min、2 h、6 h、12 h、24 h和72 h叶片的总RNA。各取30 g总RNA在1.5%甲醛变性胶上电泳并转移至尼龙膜，以TaVHA-C全长cDNA为探针进行Northern杂交，具体方法参照分子克隆第二版9。2结果与分析2.1与小麦耐盐性表达相关的差异片段的cDNA- AFLP分析利用约200对P

16、/M引物组合研究了98-160盐胁迫不同时间的基因表达变化，得到500多条差异表达片段。扩增片段长度大多在100500 bp。从图1中可以看出，大多数基因的表达没有明显变化，只有少数基因在某一特定时间点表达，如左边箭头所示，提示其可能是一些起特殊作用的调控因子，发挥完作用后迅速被降解掉；有的基因在两个不连续的时间点出现，如图中右边箭头所示，预示其可能在盐胁迫的不同时间发挥不同作用；有些只在胁迫早期出现，在胁迫晚期则消失，如中间箭头所示，推测其可能与小麦早期的盐胁迫反应有关。因此，利用cDNA -AFLP结合不同的处理条件可以研究同一基因在不同条件下的动态表达，这是很多方法无法做到的。2.2 差

17、异表达片段的分析和功能预测从500多条差异表达片段中随机选取233个进行二次扩增，成功扩增并克隆、测序的有112个。Blast-x比对结果表明，与已知基因有同源性的片段有73条，约占测序数的65.2%，编码未知功能蛋白的基因有25条，约占22.3%，另有14条片段与已知基因或序列无任何同源性，可能是尚未发现的新基因。表中仅列出了与耐盐性密切相关的18个cDNA片段的信息。有些基因只与生物的基本生长和代谢有关，在此未全列出。 1 2 3 4 5 61. CK; 2. 2 h; 3. 6 h; 4. 12 h; 5. 24 h; 6. 72 h图1 一组选扩结果（引物组合M24P26）Fig.1

18、Amplified products by primer pairs M24P26表 与小麦耐盐性相关的cDNA片段Table cDNA sequences related to wheat reaction to salt-stress类型Group编号No. of fragment大小Size (bp)编码可能的蛋白Proteins encoded物种Speciese值e value转录因子Ttranscription factor18189Ste 12-类转录因子 Ste 12-like transcription factorColletotrichum5e-05与离子转运有关Ion

19、transportion related protein58277阳离子转运蛋白 Cation transport ATPaseCytophaga1e-1494381液泡膜ATP合成酶Putative vacuolar ATP synthaseOryza sativa1e-38与信号传导有关Signal transduction related protein22207GTP-结合蛋白 Probable GTP-binding proteinFission yeast7e-2192446受体类激酶 Receptor-like kinase-likeOryza sativa2e-2298253钙

20、神经原B亚基 Calcineurin B subunitNeurospora crassa8e-12147177GTP-结合蛋白 Probable GTP-binding proteinFission yeast3e-17与胁迫有关的蛋白Stress related protein90282NBS-LRR类抗病蛋白NBS-LRR disease resistance proteinHordeum vulgare4e-19121253抗病蛋白Putative disease resistance proteinOryza sativa6e-09200170紫外伤害DNA结合因子蛋白 UV-dam

21、aged DNA binding factor - like proteinArabidopsis1e-24与蛋白相互作用有关Protein-protein interaction related protein8237分子伴侣 Putative chaperoninArabidopsis5e-1770295LRR类蛋白 Leucine-rich repeat-like proteinOryza sativa2e-08143297WD重复蛋白RBAP1 Putative WD-repeat protein RBAP1Oryza sativa4e-07151219泛素羧基末端水解酶Putativ

22、e ubiquitin carboxyl terminal hydrolaseOryza sativa6e-30197280锌指蛋白 Zinc finger proteinHomo sapiens9.2202391TPR类蛋白 Tetratricopeptide repeat (TPR)-containing proteinArabidopsis thaliana1e-37227255泛素相关蛋白 Putative ubiquitin-associated (UBA) proteinOryza sativa2e-32其它Others125206羟甲基戊二酰辅酶A裂合酶 Hydroxymethy

23、lglutaryl-CoA lyase relatedArabidopsis5e-192.3 小麦TaVHA-V全长cDNA的克隆和表达以94号片段为基础进行电子延伸，得到了1个约1.3 kb的片段，而且该片段具有完整的开放阅读框。以此电子延伸结果为基础设计引物进行PCR，得到1个1 369 bp的cDNA（图2），该片段具有完整的开放阅读框和加尾信号（aataa）。将该序列提交到NCBI图2 TaVHA-C全长cDNA的扩增Fig.2 Amplification of TaVHA-C full length cDNA进行Blast-x比对，结果表明该基因与大麦的液泡膜ATPase C亚基的同

24、源性为88%，推测其为小麦的液泡膜ATPase C亚基。以TaVHA-C全长cDNA为探针，研究了TaVHA-C在盐、干旱和低温胁迫下的表达，结果如图3。从图中可以看出，盐和干旱对TaVHA-C基因的表达影响基本一致，在胁迫的早期（02 h），TaVHA-C基因的表达基本不变，随着胁迫时间的延长（612 h），TaVHA-C基因的表达逐渐减弱，以后（2472 h）又逐渐增强，说明这是植物对胁迫的一低温胁迫(4)Leaves with low temperature (4)干旱诱导 (16.7%PEG)Leaves under PEG stress (16.1%)盐胁迫(1.5%NaCl)Lea

25、ves under salt stress (1.5%NaCl)1: CK; 2: 15min; 3: 2 h; 4: 6 h; 5: 12 h; 6: 24 h; 7: 72 h图3 TaVHA-C基因在不同胁迫后的Northern杂交结果Fig.3 Northern blot of TaVHA-C under different stresses种适应。低温对TaVHA-C基因的表达有明显的抑制作用（图3-C）。3 讨论本试验利用cDNA-AFLP技术从小麦中克隆了一些与盐胁迫反应相关的cDNA片段，它们有可能在小麦的耐盐中起重要或决定性作用。这些基因涉及范围广，几乎涵盖了与耐盐性相关的各

26、类基因。笔者得到了几个与信号传导途径有关的基因片段，如GTP结合蛋白（22号）、钙神经元B亚基（58号）等。钙神经元信号传导途径是酵母中由离子胁迫引起的信号传导途径。钙神经元CaN由催化亚基CnA和调节亚基CnB组成，CnA的催化活性需要Ca2+-CnB和Ca2+-CaM的共同参与10。将CnA和CnB一起转入烟草可提高烟草的耐盐性11。CBL（calcineurin B-like）是拟南芥中钙神经原B亚基的同源基因，在CBL1过量表达的转基因植株中，植物的耐盐性和耐旱性均增强，而抗冻性下降。这些结果说明CBL1是植物盐胁迫和干旱胁迫的正调节因子而对低温胁迫进行负调控12。其次，笔者分离到7个

27、与蛋白-蛋白相互作用相关的基因片段，其中有3个与泛素降解途径有关。SCFSkp1、Cdc53（cullin）、F-box复合体由4个亚基组成，参与了许多生长发育和激素的信号传导过 程13。F-box蛋白是SCF复合体中的一个亚基，决定了底物蛋白的特异性，如金鱼草中的AhSLF-2就是通过形成SCFAhSLF-2复合体特异识别并降解S-RNase来抑制自交亲和现象的14。前面提到的受体激酶（92号）经比对发现与水稻的一个F-box基因有同源性，推测其可能与小麦耐盐信号传导中某个组分的降解有关。还有2个与泛素降解途径密切相关的片段-泛素羧基末端水解酶（151号）和泛素相关蛋白（227号），在拟南芥

28、中，RUB是一个泛素相关蛋白，RUB对CUL1（SCF复合体中的另外一个亚基）的修饰对TIR1（生长素信号传导途径中的一个负调控因子）正常行使功能是必需的15。因此，推测TaUBA也可能与SCF复合体介导的蛋白降解途径的调节有关。因此，泛素降解途径很可能参与了小麦盐胁迫的信号传导，具体机制有待于进一步研究。第三，得到几个与离子转运有关的片段。58和94号片段编码与离子转运有关的蛋白，其中94号片段编码液泡膜ATPase C亚基。液泡对于Na+和Cl在盐胁迫下的区隔化作用十分明显。在428 mmol·L-1 NaCl中生长的烟草悬浮细胞，其液泡中可以积累780 mmol·L-

29、1的Na+和624 mmol·L-1的Cl，而在细胞中这两种离子的浓度却都低于100 mmol·L-116。当土壤中存在高盐、干旱和重金属等胁迫时，细胞的存活主要依赖V型H+-ATPase活性的维持和调整17。在盐生植物盐地碱蓬中，其抗盐的主要策略是增强V-ATPase的表达活性，从而为通过液泡膜进行离子转运提供必要的能量18。以一个cDNA-AFLP片段为基础，通过电子延伸和RT-PCR，克隆了小麦V型H+-ATPase C亚基的全长cDNA，V-ATPase中的V-ATPases C亚基是亲水性亚基，位于VHA柄部，与V-ATPases C亚基V1部分的装配/解离关系密

30、切。V-ATPases C亚基在细胞中的作用可能是作为一种锚定蛋白调节V-ATPases与肌动蛋白的联结19。在盐和干旱胁迫的早期（02 h），TaVHA-C基因的表达基本不变，随着胁迫时间的延长（612 h），TaVHA-C基因的表达逐渐减弱，以后（2472 h）又逐渐增强，说明这是植物对胁迫的一种适应。因为在胁迫的早期，Na+主要集中在根部，对叶片中V型H+-ATPase的活性影响不大；随着胁迫时间的延长，Na+向地上部分转移并大量积累在叶片中，可能导致位于膜外周的V1部分亚基的解聚，到了盐胁迫的后期，随着V型H+-ATPase各亚基之间的分工合作和调整，又重新恢复V型H+-ATPase的

31、表达活性，因此TaVHA-C基因的表达也经历了一个平衡-降低-升高这样一个动态变化的过程。这与高粱中观察到的结果一致。NaCl胁迫的初期，Na+主要在根和叶鞘中积累。相应地，根的液泡膜ATP酶和焦磷酸酶水解活性、依赖ATP和PPi的质子泵活性及Na+/H+逆向转运活性均明显增加，根的生长没有受到抑制。NaCl胁迫后期，Na+开始向地上部分运输并在叶片中积累，叶片液泡膜质子泵和Na+/H+逆向转运活性开始增加，根和叶鞘的Na/K比增加，其液泡膜ATP酶和焦磷酸酶水解活性、质子泵活性和Na+/H+逆向转运活性下降。相应地，根和叶鞘的生长也下降20。低温对TaVHA-C基因的表达有明显的抑制作用。Y

32、ashida指出细胞质酸化是冷对细胞伤害的决定因素，低温下维持细胞质环境稳定的液泡膜质子转运系统可能对细胞的冷适应至关重要21，说明冷胁迫与盐胁迫机理不同,因而它们对环境中TaVHA-C基因表达的影响也不同。有关胁迫对V型H+-ATPase各亚基表达的影响的报道并不多见。在甜菜中，V型H+-ATPase A和c亚基受发育和高盐胁迫的诱导表达22。在冰叶日中花中，只有c亚基受盐胁迫的诱导23。但有关各种胁迫对V型H+-ATPase亚基表达影响的报道尚未见到。总之，利用cDNA-AFLP可以较多地发现和分离差异表达的cDNA片段，研究其动态表达变化；将cDNA-AFLP技术与RACE、电子克隆以及

33、全长cDNA文库等全长克隆技术结合起来可以得到目的片段的全长cDNA，从而说明cDNA-AFLP技术在基因克隆尤其在大基因组作物的基因克隆中的可行性。4结论4.1 以盐胁迫后的98-160为材料，利用cDNA-AFLP技术分离得到了与盐胁迫有关的500多条差异表达片段。4.2 112个片段被克隆测序，Blast-x比对结果表明，与已知基因有同源性的片段有73条，约占测序数的65.2%，编码未知功能蛋白的基因有25条，约占22.3%。4.3 以94号片段为基础，克隆了小麦液泡膜ATPase亚基，该基因的表达受盐、干旱和低温胁迫的影响，说明该基因在植物的非生物胁迫反应中可能发挥重要作用。Refer

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