反义核酸对膀胱癌细胞系多药耐药性的逆转效应

1、    反义核酸对膀胱癌细胞系多药耐药性 的逆转效应        摘要：目的探讨多药耐药性逆转的新方法。方法应用基因重组方法构建能转录出mdr1 mRNA反义RNA的逆转录病毒质粒，然后将该质粒导入膀胱癌耐药细胞系中，测定转染细胞对不同药物的耐药性，观察反义核酸对MDR的逆转效应。结果耐药细胞经导入反义核酸逆转录病毒质粒后，对阿霉素(ADM)、秋水仙素(COL)的IC50显著降低（P0.01）；细胞膜上P-糖蛋白(P-GP)染色信号显著减弱。结论反义核酸是逆转膀胱

2、癌多药耐药性的有效方法。关键词：膀胱肿瘤癌多药耐药性Reversal of multidrug resistance of bladder cancer cell line with antisenes RNAHE Bin（Department of Urology, the Affiliated Xinqiao Hospital of the Third Military Medical University, Chongqing 400037,China）（Department of Urology, the Affiliated Xinqiao Hospital of the Third

3、 Military Medical University, Chongqing 400037,China）YANG Tangjun（Department of Urology, the Affiliated Xinqiao Hospital of the Third Military Medical University, Chongqing 400037,China）JIN Xiyu,et al.（Department of Urology, the Affiliated Xinqiao Hospital of the Third Military Medical University, C

4、hongqing 400037,China）Abstract：ObjectiveTo explore the new reversal method of multidrug resistance of bladder cancer cell line.MethodsA retroviral plasmid pLXSN-AS(+) containing the mdr1 mRNA antisense gene was cloned by inserting 1383bp fragment of mdr1 cDNA into multiple cloning sites of retrovira

5、l vector pLXSN. For evaluating the reversal efficiency of antisense RNA the recombinant plasmid pLXSN-AS(+) was transfected into multidrug resistant cell lines BHA-60 with liposome.ResultsAfter the recombinant plasmid pLXSN-AS(+) being transduced, the BHA-60 cell line showed significant decrease of

6、IC50 to drug (P0.01)and the P-GP positive signal.ConclusionsAntisenseis a valuable method to reverse multidrug resistance of bladder cancer cell line.Key words：Bladder neoplasmsCarcinomaMultidrug resistance为探讨膀胱癌多药耐药性（MDR）逆转的方法，我们构建了能转录出mdr1 mRNA反义RNA的逆转录病毒质粒，然后将该质粒导入耐药的膀胱癌细胞系BHA-60中，观察反义核酸对MDR的逆转效应

7、。报告如下。材料与方法一、材料1、BIU-87 细胞：人膀胱癌移行上皮细胞系，引自北京医科大学泌尿外科研究所。BHA-60细胞为本实验室应用转基因方法建立的多药耐药细胞系1。2、pLXSN：逆转录病毒载体，在其多克隆位点上游含启动子5- LTR，在其多克隆位点下游含SV-40启动子和Neo基因，由美国Miller教授惠赠。质粒pHDR5A由美国Gottesman教授2惠赠。3、主要试剂：（1）脂质体（DoTap）、TriPure(tm) RNA提取试剂盒、DNA快速连接试剂盒，购自德国Boehringer Mannheim公司。（2）G418为美国Gibercol BRL公司产品，用20mmo

8、l/L的HEPES稀释成100g/l，0.2m过滤器过滤除菌，分装后保存于-20备用。二、方法1、细胞培养：细胞置于37，含5%CO2的孵箱中培养，培养液为含有10%新生小牛血清的RPMI-1640。2、反义核酸质粒的构建：用EcoR I酶切质粒pHDR5A，获得1 383bp长的mdr1 cDNA；逆转录病毒载体pLXSN经EcoR I酶切后经CIAP脱磷酸化，制备线性化载体，将mdr1 cDNA与线性化pLXSN载体连接，经氨苄青霉素抗性筛选，再用Hind 酶切鉴定1 383bp mdr1 cDNA的插入方向，克隆出正向插入1 383bp mdr1 cDNA的逆转录病毒质粒pLXSN-AS

9、 （+）， 该质粒能在细胞内表达长1 383nt的mdr1 mRNA的反义RNA。3、逆转录病毒质粒pLXSN-AS（+）对细胞BHA-60的转染：按说明书进行操作。选择性培养基为含G418（终浓度为800g/ml）的1640培养基，定期更换新鲜培养液，共选择培养1416天，长出肉眼可见克隆，该细胞系命名为BHA-AS。同时用pLXSN作为空载体转染对照。4、细胞耐药性及细胞对ADM、COL半数抑制量（IC50） 的测定采用MTT法3。5、细胞膜上P-糖蛋白（P-GP）免疫组化染色采用ABC法4。结果一、反义核酸逆转录病毒质粒pLXSN-AS(+)的构建1 383bp的mdr1 cDNA片段，

10、与pLXSN脱磷酸化载体加入T4 DNA连接酶，连接液常规方法导入大肠杆菌JM109中，挑选经Amp筛选的3个转化子，小量扩增，提取质粒。用Hind酶切鉴定插入方向，结果见1所示。转化子3为正向插入，在5'-LTR启动子作用下能转录出mdr1 mRNA反义RNA。    1pLXSN-AS(+)的筛选结果(0.8%琼脂糖凝胶)1.DNA/Hind+EcoR标样；2.重组子1+Hind；3.重组子2+Hind；4.重组子3+Hind    2pLXSN-AS(+)的限制性酶切分析结果(0.8%琼脂糖凝胶)1.

11、pLXSN-AS(+)无酶对照；2.pLXSN-AS(+)+BamH；3.pLXSN-AS(+)+Hind；4.pLXSN-AS(+)+EcoR；5.pLXSN-AS(+)+EcoR+Hind；6.DNA/Hind+EcoR标样pLXSN-AS(+)经大量扩增，限制性酶茏?汲?dr1 mRNA反义RNA的逆转录病毒质粒，然后将该质粒导入耐药的膀胱癌细胞系BHA-60中，观察反义核酸对MDR的逆转效应。报告如下。材料与方法一、材料1、BIU-87 细胞：人膀胱癌移行上皮细胞系，引自北京医科大学泌尿外科研究所。BHA-60细胞为本实验室应用转基因方法建立的多药耐药细胞系1。2、pLXSN：逆转录病

12、毒载体，在其多克隆位点上游含启动子5- LTR，在其多克隆位点下游含SV-40启动子和Neo基因，由美国Miller教授惠赠。质粒pHDR5A由美国Gottesman教授2惠赠。3、主要试剂：（1）脂质体（DoTap）、TriPure(tm) RNA提取试剂盒、DNA快速连接试剂盒，购自德国Boehringer Mannheim公司。（2）G418为美国Gibercol BRL公司产品，用20mmol/L的HEPES稀释成100g/l，0.2m过滤器过滤除菌，分装后保存于-20备用。二、方法1、细胞培养：细胞置于37，含5%CO2的孵箱中培养，培养液为含有10%新生小牛血清的RPMI-1640

13、。2、反义核酸质粒的构建：用EcoR I酶切质粒pHDR5A，获得1 383bp长的mdr1 cDNA；逆转录病毒载体pLXSN经EcoR I酶切后经CIAP脱磷酸化，制备线性化载体，将mdr1 cDNA与线性化pLXSN载体连接，经氨苄青霉素抗性筛选，再用Hind 酶切鉴定1 383bp mdr1 cDNA的插入方向，克隆出正向插入1 383bp mdr1 cDNA的逆转录病毒质粒pLXSN-AS （+）， 该质粒能在细胞内表达长1 383nt的mdr1 mRNA的反义RNA。3、逆转录病毒质粒pLXSN-AS（+）对细胞BHA-60的转染：按说明书进行操作。选择性培养基为含G418（终浓度

14、为800g/ml）的1640培养基，定期更换新鲜培养液，共选择培养1416天，长出肉眼可见克隆，该细胞系命名为BHA-AS。同时用pLXSN作为空载体转染对照。4、细胞耐药性及细胞对ADM、COLZ讨论20多年前，当人们首次在微生物体内发现基因表达过程中出现RNA-RNA互补现象时，提出了任何基因的功能都可以通过反义核酸加以抑制的假设5。1978年Hastic等6首先在体外实验中实现这一假设，Zameenik等7应用反义寡核苷酸（aODN）在Rous肉瘤病毒复制研究过程中实现了细胞培养条件下的基因阻断。反义核酸阻断基因表达的机制是与靶RNA以碱基互补原则相结合，形成的DNA-RNA复合物是细胞

15、内RNA酶H的作用底物，易被RNA酶H所破坏，另一方面，DNA-RNA复合物和RNA-RNA复合物阻断了mRNA的转录或mRNA与某些转录蛋白质相结合，从而抑制蛋白质的合成8。Quattrone等9将10mmol/L的18mer的aODN与人源性大肠癌细胞系共同孵育15天，结果该细胞系的耐药性下降50%。Tominaga等10在研究P-GP 与氯离子通道活性时也发现aODN能显著降低P-GP的合成。尽管aODN有易于合成和较高阻断活性等特点，但对导入的aODN数量要求较高，且多为短期效应。本实验将mdr1 cDNA 1 383bp片段亚克隆于逆转录病毒载体pLXSN上，重组出能在细胞内转录出反义核酸的逆转录病毒质粒，该质粒经导入到靶细胞后能在细胞内转录出1 383nt的mdr1 mRNA反义核酸。结果表明，转染pLXSN-AS（+） 后，细胞对ADM的耐药性显著降低；免疫组化染色也表明，细胞膜P-GP含量明显减少。由于重组反义核酸避免了aODN需要反复导入等弱点，反义核酸能在重组逆转录病毒质粒导入细胞后能长期表达，从而达到有效的逆转MDR的目的。反义核酸进行MDR逆转也有其缺点，由于重组的反义核酸较长，转录后有可能形成自身折叠结构，影响其与靶RNA的结合，因而逆转的效应并不完全。另外，反义核酸的作用还受到细胞内其它因素如核蛋白等的影响。尽管如此，反义核酸仍不失为一种