抗肿瘤抗生素力达霉素

1、抗肿瘤抗生素力达霉素摘要:力达霉素属于烯二炔类抗肿瘤抗生素,可以通过发酵、生物合成以及化学合成获得。力大霉素由一个酸性蛋白和一个烯二炔发色团通过非共价键结合而成,通过多种作用机制在体内外对多种肿瘤产生强烈的抗肿瘤作用。目前,力达霉素已经进入期临床研究,本文介绍了力达霉素的发酵及生物、化学合成方法,抗肿瘤作用和分子作用机制方面的新进展。关键词:力达霉素;发酵工艺抗肿瘤作用Abstract: Lidamycin, a member of the enediyne anticancer antibiotics family. Can be acquired by fermentation,biosy

2、nthesis,chemosynthesis. Lidamycin is composed of chromophore andapoprotein with noncovalent binding. It exerts potent antitumor activities on a variety of cancer in vitro and in vivo by different mechanisms. Lidamycin is currently evaluated in Phase II clinical trials. In this review we discussed re

3、centprogresses in fermentation , biosynthesis , chemosynthesis ,molecular mechanisms and antitumor activities of lidamycin.Key words: Lidamycin; Fermentation process;Antitumor activity前言力达霉素(lidamycin, LDM原名C1027,是从我国湖北省潜江县土壤中分离出的一株链霉菌Streptomyces globisporus c-1027产生的大分子肽类抗肿瘤抗生素,它是采用精原细胞法筛选得到的,其结构独

4、特,由一个含110个氨基酸的酸性蛋白(MW10, 500和一个含烯二炔结构的发色团(MW 843通过非共价键结合而成(图1,属于烯二炔类抗肿瘤抗生素。LDM在体外对多种肿瘤细胞具有强力的杀伤作用,在体内对小鼠移植肿瘤L1210、P388和S180等有明显的抑制作用,对移植于裸鼠的人体肿瘤也有抑制作用。LDM分子可以进行拆分重建,发色团是LDM的活性部分,当发色团烯二炔芳构化后其活性丢失;蛋白对发色团起保护作用,游离发色团容易失活,重建LDM与天然LDM活性相同。目前,LDM在国内已进入期临床研究,现就力达霉素的分子结构与生物合成、化学合成、抗肿瘤作用及其分子作用机制等方面的研究工作成果作一综述

5、。 一、力达霉素的分子结构力达霉素为新型烯二炔类抗肿瘤抗生素,它由1个辅基蛋白和1个发色团成。蛋白部分由110个氨基酸组成, 含有2个分子内二硫键, 计算相对分子质量为10500u,蛋白质部分没有抗肿瘤活性, 但对发色团有稳定和保护作用,并携带发色团到达肿瘤部位。发色团在抗肿瘤活性中发挥主要作用,发色团由1个9元环1, 52二炔232烯核心结构与氮氧杂萘甲酸、氨基吡啶核糖和B2酪氨酸结合而成。这些结构单元不但参与化合物分子的组成, 而且与化合物的生物活性密切相关。借助核磁共振对辅基蛋白及其与发色团的复合物进行结构分析并确定各个结构单位的相对位置, 发现芳构化的发色团结合在辅基蛋白结构中的“疏水

6、口袋”处, 它们之间的亲和性可能来自辅基蛋白“疏水口袋”区氨基酸侧链与发色团之间形成静电和疏水作用。二、力达霉素的发酵工艺材料和方法1 菌株力达霉素产生菌Streptomyces globisporus C-1027-20(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存,入册编号CGMCC No.0704 。2 培养基斜面培养基(g ·100 mL -1 : 可溶性淀粉2.0,3KNO 0.1,32PO KH ·O H 20.05, 4MgSO ·O H 270.05 , 4FeSO 0.001 ,NaCl0.05 ,琼脂粉1.5,pH7.0。种子及发酵培养基(g

7、 ·100 mL -1:淀粉1,葡萄糖0.5,血胨0.5,玉米粉1.5,玉米浆0.5, 4MgSO ·O H 270.02,KI 0.06, 3CaO 0.4 ,豆油0.3,pH7.0 。3 培养条件用冷干管中保存的菌种在斜面培养基上传代培养,28培养710d ,传23代,备用。一级种子用500mL 三角瓶内装100mL 培养液,从斜面挖块接种,在转速为190r ·min -1的旋转摇床上28培养48 h 。二级种子用5000mL 三角瓶,内装1000mL 培养液,接种量为10% ,在振荡速率为90r ·min -1的来回摇床上28培养24h 。发酵培养

8、用200L 发酵罐,内装培养液100L ,接种量为2% ,搅拌速度200r ·min -1,28培养约96h 放罐。4 检测方法微生物测定法检测发酵液中力达霉素的含量:取发酵液适当稀释,检定菌为枯草芽孢杆菌CMCC(B 63501 ,标准品的浓度为5g ·mL -1 ,用一剂量法测定力达霉素发酵液的抗菌活性。用二剂量法测定力达霉素发酵提取物的抗菌活性,剂量为12g mL -1·与3g ·mL -1。HPLC 法测定力达霉素发酵提取物的含量:精密称取待测样品和标准品510mg ,用蒸馏水溶解于5mL 容量瓶中,用于HPLC 测定。色谱条件:Waters 高

9、效液相色谱仪( 600 泵, 2487 紫外检测器,Millennium32色谱工作站 ; 色谱柱:Waters Delts PakC4 柱( 319 mm ×150 mm , 5m , 30 nm ; 流动相:01025 %三氟乙酸2乙腈(2377 ;检测波长:350 nm 。液相色谱图见图2。分别测定力达霉素样品及标准品发色团的峰面积,按照外标法计算样品的效价。 图2力达霉素典型液相色谱图精原细胞法测定力达霉素抗肿瘤活性:使用体重2228g的雄性小鼠,分别于2侧睾丸内注射被试样品的溶液。每一种样品的每一浓度用23只动物。注射后24d(一般为3d处死动物,取睾丸固定于Bouin氏液

10、,石蜡包埋切片,切片厚度为5m ,苏木精2伊红染色,显微镜下观察结果。药物引起的精原细胞的特异性消失作为阳性。结果表1为5批中试发酵液的测定结果,表2为5批中试发酵提取物的测定结果。结果显示:5批发酵液微生物效价平均为450g·mL-1 ;5批100 L发酵罐平均每罐产合格的力达霉素精品517g。 经过多批中试,摸索出了上罐条件,为力达霉素生产的下游提取提供了充足的发酵液,经过分离纯化,积累了足够的临床试验用药。讨论此生产菌种较稳定,发酵培养基较廉价,发酵工艺过程也很好控制。发酵液放罐后,由于力达霉素在常温下不稳定,故发酵液提取须在低温(10以下避光条件下迅速提取,以避免活性成分的丢

11、失。力达霉素3种检测方法中,HPLC法最准确,但不能直接测定发酵液效价;微生物检定法易操作,经济实用,但不如HPLC法精确;精原细胞法可以测定样品是否具有抗肿瘤活性,但不易操作。故在发酵液生产阶段用微生物法测定含量,原料药用HPLC法和微生物法测定含量。从表2结果可以看出,微生物法及HPLC法测定得出的结果是平行一致的。三、力达霉素化学合成的研在力达霉素的化学结构得到解析后, 很多实验室都进行着有关力达霉素化学合成方面的工作, 希望通过化学手段可以合成出活性相当乃至更强的化合物。根据逆合成分析,朱锦桃等合成了烯二炔发色团中五元环状中间体, 并在此基础上合成了发色团中烯二炔单元的开链衍生物, 但

12、并未得到闭环的烯二炔结构。Inoue 等在对发色团的结构进行了充分研究之后对发色团的骨架结构和烯二炔的双环结构进行了合成。由于辅基蛋白Gly96的H原子参与发色团芳构化后的自身降解, 该实验室还利用同位素氘(D取代辅基蛋白Gly96的H原子, 改造后的辅基蛋白类似物由于动力学同位素的效应减小了发色团结构降解的速率, 增加其稳定性。Semmelhack 等报道了由甘露糖出发经12步反应合成力达霉素发色团氨基糖结构单元的路线, 认为合成反应的关键步骤在于C24位的内部N取代从而引顺式氨基以及C25位上烯醇化物的甲基化。四、力达霉素的生物合成力达霉素的发色团核心的烯二炔结构的生物合成途径一直是人们关

13、注的焦点。烯二炔结构中首尾相接的乙酸结构单元曾被推测是由不饱和脂肪酸的前体被切割和环化后形成或是通过聚酮合成途径, 由烯二炔聚酮合成酶(polyketide synthase, PKS 催化聚线性不饱和聚酮中间产物的生物合成,接着采用一种新颖的环化机制而形成烯二炔核心结构。刘文等运用PCR方法成功地克隆了力达霉素脱氧氨基糖代谢途径中的dNTP2葡萄糖24, 62脱水酶基因(sgcA ,并以此为探针,通过基因文库筛选和染色体步移克隆了完整的生物合成基因簇,发现力达素的生物合成起源于聚酮代谢途径, 并确定了基因簇编码1个烯二炔聚酮合成SgcE,排除了由脂肪酸合成然后降解的可能性。除了聚酮合成酶Sg

14、cE, 刘文等还提出了一系列途径特异的结构基因分别控制各个结构单元的合成。sgcE2-sgcE11、sg cI、sgcJ 、sgcL 和sgcF 等16 个基因负责烯二炔核心的合成; sgcA-sgcA6 等7个基因sgcA1-sgcA6参与脱氧氨基糖的合成; sgcC-sgcC5 6等基因参与-氨基酸的合成sgcD-sgcD6等7个基因负责杂萘苯环的合成。通过各自途径生物合成的这三个结构单元分别在糖基转移酶(SgcA6、缩合酶(SgcC5 和酰基转移酶(SgcD6的催化作用下, 与烯二炔核心结合, 构成完整的力达霉素发色团分子。对力达霉素生物合成基因簇中结构基因的研究正在进行中, 通过生物信

15、息学的分析、在链霉菌中的基因中断实验以及利用基因工程手段将结构基因的片段克隆至大肠埃希菌表达载体中并对表达产物进行酶学分析可以确定这些结构基因在力达霉素生物合成中的相关功能, 并获取更多生物合成途径中有关中间产物和反应步骤的信息。目前已陆续报道了sgcD、sgcA 1、sgcC1 等结构基因的研究分析结果。 五、力达霉素的抗肿瘤作用1 体外抗肿瘤作用LDM是经过精原细胞法筛选得到的,在体外具有极强的杀伤肿瘤细胞的作用。按克隆生存测定的IC(半数抑制浓度比较,比常用的抗肿瘤药物如阿霉素(ADR50和丝裂霉素(MMC等强10000倍以上(表2。研究室也采用MTT法观察了LDM对不同肿瘤细胞的细胞增

16、殖抑制作用,其IC值在10-1010-12mol/L之间,作用均强于丝50裂霉素和阿霉素,显示出LDM对肿瘤细胞极强的杀伤作用(表3。同时,我们体外的研究结果也表明,LDM对多药抗药性(MDR癌细胞仍显示强烈的增殖抑制作用,表明多药抗药性癌细胞对LDM无明显的交叉抗药性。不同浓度的LDM分别作用于药物敏感乳腺癌MCF-7细胞和多药耐药乳腺癌MCF-7/ADR细胞72h,进行MTT分析,LDM 的IC50值依次为0.017nmol/L和0.028nmol/L,抗药倍数为1.6,多药耐药乳腺癌细胞对LDM没有抗性。不同浓度的LDM分别作用于药物敏感口腔鳞癌KB细胞和耐长春新碱的多药耐药口腔鳞癌KB

17、V200细胞72h,进行MTT分析,LDM的IC50值依次为0.035nmol/L和0.24nmol/L,抗药倍数为6.8,多药耐药和敏感口腔鳞癌细胞对LDM 的敏感性没有显著性差异。不同浓度的LDM分别作用于药物敏感肝HepG2细胞和经稳定转染并高表达多药耐药基因mdr1的多药耐药肝癌HepG2/mdr-1细胞72h,进行MTT分析,LDM的IC50值依次为0.015nmol/L和0.020nmol/L,抗药倍数为1.3,经稳定转染并高表达多药耐药基因mdr1的多药耐药肝癌细胞对LDM没有抗性。因此, LDM在体外对肿瘤细胞具有强烈的杀伤作用,与多药耐药性肿瘤细胞之间不存在明显的交叉抗药性。

18、表2 力达霉素对不同人肿瘤细胞的细胞毒作用(克隆形成法比较 表3 LDM对不同肿瘤细胞的细胞毒作用比较(MTT法 2 体内抗肿瘤作用LDM在体内也能抑制肿瘤的生长,对小鼠移植性肿瘤包括实体瘤和白血病均有显著抑制作用,对移植于裸鼠的人体肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、肝癌等均有显著疗效。小鼠体内试验结果表明LDM对小鼠移植性肿瘤均显示剂量依赖性的肿瘤生长抑制作用,在最大耐受量(MTD情况下,LDM(0.1mg/kg对肝癌22的抑瘤率为84.7%,对肉瘤180的抑瘤率为90%,LDM能显著抑制小鼠移植瘤白血病L1210的生长,而且能明显延长小鼠的寿命。裸鼠体内实验结果表明,LDM对移植于裸鼠的人肺癌P

19、G显示剂量依赖性的肿瘤生长抑制作用,在可耐受剂量,LDM的抑瘤率为53-64%。LDM(0.04mg/kg对移植于裸鼠的胰腺癌SW1990的肿瘤抑制率78%,对移植于裸鼠的胃癌BCG823的肿瘤生长抑制率为72%,对移植于裸鼠的肝癌BEL-7402的肿瘤生长抑制率为68.7%。3 联合用药的抗肿瘤作用研究两药相互作用一般采用两药相互作用指数(coeffi cient of druginteraction,CDI进行评价。一般情况下,当CDI<1时两药有协同作用;当CDI<0.7时,协同作用非常显著。在体外,LDM和抗肿瘤药物联合应用存在几种不同的作用情况。LDM和顺铂联用对非小细胞

20、肺癌细胞A549、肝癌细胞Bel-7402的增殖存在明显的协同抑制作用。当顺铂剂量为10mol/L、LDM为0.03nmol/L时,对A549细胞的生长抑制率分别为74.49%和45.94%,联用时为91.41%,CDI<0.7,存在明显的协同作用。当顺铂剂量为0.3mol/L、LDM为0.03nmol/L时,对Bel-7402细胞的生长抑制率分别为25.1%和37%,联用时为95%,CDI<0.7,存在明显的协同作用。1nmol/L LDM 与500nmol/L吉西他滨联用,能够明显抑制胰腺癌细胞PANC-1增殖,CDI<0.75,具有协同抗肿瘤作用。0.1nmol/L L

21、DM与5mol/L gefitinib联合作用时,能够显著抑制肺癌细胞H460增殖,其CDI<0.70,具有显著协同抗肿瘤作用。0.01nmol/LLDM与0.1mol/L gefitinib联合作用时,能够明显抑制表皮样癌A431细胞增殖,其CDI<0.70,具有显著协同抗肿瘤作用。4 作为靶向治疗的“弹头”抗体偶联物或称免疫偶联物,由抗体或抗体片段与“弹头”药物连接而成。可用作“弹头”的物质有放射性核素、化疗药物与毒素。这些“弹头”物质与抗体连接,分别构成放射免疫偶联物、化学免疫偶联物与免疫毒素。2000年FDA批准用于治疗复发性急性髓性白血病的Mylotarg就是一种免疫偶联

22、物,它是由抗CD33分子的单抗和抗肿瘤抗生素calicheamicin连接而成,在抗肿瘤单抗药物中,是第一个获批准上市的单抗偶联物。Mylotarg的研究与开发表明,单抗偶联物可以作为一种技术平台,即利用特定的“弹头”药物分别与不同的单抗进行连接,制备靶向性各异的单抗偶联物。肿瘤的靶向治疗已经成为当今抗肿瘤研究的一大热点,而抗体治疗是肿瘤靶向治疗的一个主要途径,同时,抗体治疗的高效化也是肿瘤治疗高效化的一个途径。采用高效的“弹头”来制备免疫偶联物是实现抗体治疗高效化的一个思路。calicheamicin对肿瘤细胞的杀伤活性比阿霉素1000倍,LDM对癌细胞的杀伤作用比阿霉素强10000倍以上,

23、二者都可以作为高效的“弹头”来制备免疫偶联物。事实上,LDM作为高效“弹头”的免疫偶联物也正在研究阶段。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs参与肿瘤的生长和扩散过程,在多种肿瘤中过度表达,是向肿瘤运载高效细胞毒药物的重要靶标。MMPs 家族的重要成员IV型胶原酶可以降解基底膜中作为其他组分构建支架的IV型胶原,从而有利于肿瘤细胞破坏和穿透基底膜进行侵袭和转移,并在肿瘤的新生血管形成过程中发挥重要的作用。基质金属蛋白酶(MMPs 因与恶性肿瘤的生长、转移和血管生成关系密切而成为引人注目的研制抗癌药物的分子靶点。以MMPs 家族中与肿瘤生长和转移关系最为密切的

24、成员IV 型胶原酶作为抗原,制备了抗IV型胶原酶单抗,该抗体能够与IV型胶原酶特异性结合并抑制其活性,由其衍生的抗体片段在肿瘤治疗中显示出良好的靶向性和选择性。本所肿瘤研究室构建了抗IV型胶原酶单抗3G11与LDM偶联物3G11-LDM,此偶联物保留了单抗3G11与IV型胶原酶和靶细胞H22细胞的结合能力,体外试验H22细胞显示比游离LDM更强的细胞增殖抑制作用。体内3G11-LDM偶联物0.05mg/kg和0.10mg/kg对小鼠移植性肝癌H22的抑瘤率分别为87.8%和97.2% ,而游离LDM 0.05mg/kg的抑瘤率为67.1% ,且3G11-LDM偶联物组小鼠的中位生存时间比LDM

25、组明显延长。3G11-LDM偶联物对小鼠移植性肝癌H22的抑瘤作用比LDM强, 3G11-LDM偶联物在动物实验中取得的良好疗效,为进一步研究和开发以LDM作为“弹头”的单抗靶向药物提供依据。LDM可以与不同的抗体联用,也显示出了较单药LDM更好的抗肿瘤作用,从而预示LDM作为免疫偶联物的“弹头”,具有良好的临床应用前景。5 抑制肿瘤的侵袭和转移基质金属蛋白酶在肿瘤细胞对基底膜的降解中发挥重要作用,其中以IV型胶原酶(包括MMP-2和MMP-9尤为重要。金属蛋白酶活性可被特异性金属蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs阻断,已发现

26、和克隆的TIMPs 家族有TIMP-1、2、3、4共4种。在恶性肿瘤中不仅有高水平的MMPs,而且常发现TIMPs的水平下降,MMPs与TIMPs动态平衡的失调可能是决定肿瘤恶性表型的关键因素。LDM可以促进TIMP-1的表达,抑制MMP-9的表达,LDM可能通过抑制IV型胶原酶的产生,同时又诱导金属蛋白酶抑制因子的产生,从而表现出抗侵袭活性。0.025、0.05、0.1mg/kg LDM对小鼠结肠癌C26肝内移植瘤的抑瘤率分别为74.5%、82.3%和92.8%,对脾内移植瘤抑瘤率分别为9.2%、25.8%和70.2%,对肝转移灶的总抑制率分别为34.6%、50.7%和76.3%,对大于2m

27、m转移灶的抑制率分别为56.6%、56.7%和90.8%。用LEICAQWINV3图像分析系统分析肝转移病理切片“以肝脏病理切片中肿瘤转移面积占所检查肝脏病理切片总面积的比例”作为评价指标,0.1mg/kg LDM对肝转移灶的抑制率为71.2%。LDM明显抑制小鼠结肠癌在皮下/盲肠/肝内和脾内移植瘤的生长,对肝转移灶也有显著抑制作用。因此,LDM具有抑制肿瘤侵袭和转移的作用。六、力达霉素抗肿瘤作用的分子机制1 针对DNA和RNA的损伤作用LDM具有DNA断裂作用,可以引起单链和双链DNA断裂,并可引起脱碱基断裂作用。LDM在无巯基还原剂的情况下断裂双链DNA,且具有核苷酸序列特异性,如CTTT

28、T/AAAAG,ATAAT/ATTAT,CTTTA/TAAAG,CTCTT/AAGAG,尤其对GTTAT/ATAAC 特异性更强,内含两处切割位点。LDM发色团结合并嵌入到DNA双螺旋分子的小沟中,烯二炔分子结构发生改变,形成苯环型的双自由基中间体,双自由基通过夺取核苷酸核糖骨架的氢原子,在有氧条件下使核糖基团氧化,引起DNA单链、双链断裂或形成脱碱基断裂; 在厌氧条件下DNA互补双链的脱氧核糖自由基与药物分子共价作用形成DNA的链内交联,引起DNA断裂。据报道,LDM切割细胞内DNA的活性是无细胞环境中的285倍,对细胞内DNA的切割顺序依次为:细胞内的附加体DNA > 线粒体DNA

29、>> 基因DNA。尽管LDM可以作用于不同形式DNA,但其引起的DNA损伤信号的传递却不依赖于传统的ATM、ATR和DNA-PK激酶途径。LDM发色团对RNA也具有断裂作用。LDM对转运苯丙氨酸的转运RNAtRNA(Phe具有独特的活性。在Mg2+存在下,tRNA(Phe保持一种稳定的三维结构,LDM发色团对其反密码子环表现出高度的选择性断裂作用。LDM能够抑制肿瘤细胞DNA和RNA合成。应用氚掺入法研究表明,LDM能强烈抑制肝癌细胞BEL-7402的DNA和RNA合成,对蛋白质总体合成没有显著作用。2 细胞周期阻滞作用LDM能够诱导细胞周期阻滞,此作用与肿瘤抑制基因p53的状态相

30、关。在p53为野生型的MCF-7细胞,小剂量LDM诱导细胞出现G1期阻滞,在较高剂量情况下,随着p53和p21表达的增加,LDM诱导细胞出现G1和G2/M期阻滞;同时降低RB和CDK 的磷酸化以及cyclin B1、cdk1的蛋白表达水平。与此相反,LDM仅诱导p53突变型细胞MCF-7/ADR出现G2/M期阻滞。LDM诱导HT-29细胞出现G2/M期阻滞与Chk1、Chk2、Cdc25C、Cdc2的磷酸化以及Cdc2和cyclin B1的表达增加相关,而且,p38 MAPK也参与LDM诱导的G2阻滞作用。最近研究表明,靶向细胞周期“关卡”的肿瘤治疗方式能够增加DNA损伤剂的细胞毒作用,如果调

31、低Chk1的表达,则能消除LDM引起的结肠癌HCT116细胞出现的G2/M期阻滞,并促进肿瘤胞凋亡。细胞周期阻滞在LDM抗肿瘤作用中的机能还需要进行进一步的研究。3 细胞凋亡、裂亡和衰老样表型LDM能够诱导肿瘤细胞凋亡和裂亡,并出现衰老样表型。细胞凋亡是受基因调节的自主控制过程,在机体发育和自稳态的维持中产生生理作用。但是,肿瘤细胞凋亡是许多抗肿瘤药物产生抗肿瘤作用的机制之一。在凋亡的过程中,凋亡细胞皱缩、变圆,脱离支持物表面;染色质凝集、边缘化,形成凋亡小体;核小体连接区被活化的核酸内切酶特异水解;DNA修复被抑制;琼脂糖电泳出现DNA 片段梯;流式细胞术检测往往可观察到凋亡特异的亚G1期峰

32、。LDM (0.1-10nmol/L处理早幼粒白血病HL-60细胞2h,能诱导HL-60细胞出现凋亡的形态学改变,如核固缩、染色质凝集和凋亡小体的出现,并诱导HL-60细胞出现典型的DNA片段梯,流式细胞术表明,5nmol/L LDM可以诱导79% HL-60细胞凋亡。一般情况下,可以将细胞凋亡分为线粒体凋亡和细胞外凋亡途径,LDM能迅速激活肿瘤细胞线粒体凋亡通路,在2h内就引起线粒体中细胞色素C释放至细胞质中。同时Bcl-2家族成员中促凋亡成员Bax持续增加,而抗凋亡成员Bcl-2先增加后减少,p53蛋白在6h 显著增加。Bax蛋白表达升高与其mRNA转录水平升高有关,p53蛋白表达升高与转

33、录后水平相关。Caspase抑制剂可以部分抑制LDM的细胞毒性。细胞裂亡是一种不同于细胞凋亡的死亡方式,是指细胞经过一次有丝分裂后才开始死亡的现象。裂亡与凋亡具有各自不同的形态学和生化学特征。细胞裂亡的特征主要包括: G1/S期细胞关卡缺失或延迟,细胞阻滞于G2期,有丝分裂异常,细胞体积变大,形成多核细胞,DNA出现多倍化,琼脂糖电泳的DNA泳带弥散等。低浓度LDM(0.01-1 nmol/L引起人肝癌BEL-7402细胞发生细胞裂亡,并使细胞的生长速率均明显降低,增殖受到抑制;裂亡细胞呈现出G2+M 期延长,细胞体积增大,多核化,异常染色体核型积累,其特征明显不同于典型凋亡。LDM引起细胞形

34、成中心体过复制,进而形成多极纺锤体,导致多极分裂、不均匀分裂等异常有丝分裂的出现。中心体复制循环及其数量不能与其它细胞周期事件精确匹配是LDM诱导细胞裂亡的内在机制之一,异常中心体的积累与细胞G2+M期阻滞有关。低剂量LDM可降低人肝癌BEL-7402细胞中p53和p21的蛋白表达水平,同时增加p38和p-ERK的蛋白表达,提示LDM引起肿瘤细胞裂亡与p53、p21表达下调而造成的细胞DNA损伤修复能力的下降有关。在细胞体积增大这一形态学变化上,裂亡细胞与衰老细胞有相似之处。衰老相关的-半乳糖苷酶(SA-gal的表达是迄今为止公认的衰老相关的生物学指标之一,虽然研究发现SA-gal阳性细胞和其

35、阴性细胞似乎具有相似的裂亡发生概率,但仍不能排除裂亡与衰老在信号转导通路上可能存在着某种程度的交叉。0.1nmol/L LDM 处理人肝癌BEL-7402细胞2h 后继续培养72h,则肝癌细胞呈现类似于正常衰老的特征:细胞体积增大,平铺,粒度上升,液泡空化,SA-gal阳性细胞增多等;1nmol/L LDM 作用于人乳腺癌MCF-7细胞,可使55.5%的细胞呈现衰老样表型,因此,LDM的抗肿瘤作用可能与其诱导肿瘤细胞衰老相关。2.4 抗血管形成作用肿瘤生长和转移依赖于血管生成,因此,抑制肿瘤血管生成是治疗肿瘤的一个有效途径。研究认为,肿瘤中血管的来源可能存在三种途径:肿瘤周围组织血管以发芽的方

36、式形成血管;骨髓中的内皮祖细胞动员形成肿瘤中的新生血管;间充质干细胞分化成内皮细胞参与肿瘤的血管形成。当肿瘤不能从邻近组织中募集到内皮细胞时,骨髓来源的内皮祖细胞将作为主要来源参与肿瘤血管床的新生血管生成,这种情况在正常血管生成则很少发生。LDM有很强的抑制血管生成作用,在低剂量(0.01微克/鸡胚即可抑制鸡胚尿囊膜的血管形成,并且可以阻断bFGF 与受体蛋白结合,其IC50为2.3×10-6g/mL。LDM可显著抑制正常的和bFGF刺激的牛主动脉内皮细胞的生长,IC50值为9.81×10-10mol/L。LDM能抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC、大鼠脑微血管内皮细胞(rC

37、MEC、人脐血内皮祖细胞(EPC的增殖,浓度为0.1-2nmol/L能诱导内皮细胞凋亡,并能抑制血管内皮细胞和内皮祖细胞的小管形成、明胶酶分泌以及侵袭和转移。LDM对骨髓间充质干细胞的增殖也具有抑制作用。高度侵袭性的黑素瘤细胞和前列腺癌细胞具有类似血管生成的能力,其肿瘤微循环血管通道的形成并不需要内皮细胞的参与,也不依赖于血管生成。因此,以内皮细胞为靶点抑制血管生成的药物不一定能有效地治疗肿瘤。考虑到这一点,治疗的策略应该是既要抑制血管生成也要杀伤肿瘤细胞。LDM兼有强烈的抑制血管生成作用和强烈的杀伤肿瘤细胞活性,从这一治疗策略而言, LDM的抗肿瘤作用具有本身的优势和特点。5 对其他细胞信号

38、传导通路的影响(1力达霉素对细胞中K-ras、Akt、NF-B等信号的影响胰腺癌的发生是多步骤多基因突变的结果,胰腺癌的基因突变主要包括K-ras、Her-2、p16、p53、DCP4及BCRA2等,其中K-ras基因突变率为80%。胰腺癌中K-ras的基因突变主要通过ras-PI3K-Akt途径促进癌细胞增生、抗凋亡,同时,在复杂的细胞信号调节网络中K-ras基因突变还影响其他多个信号传导途径,使它们共同参与促进癌细胞增生和迁移。肿瘤核转录因子NF-B的活化是肿瘤抗药性产生的机制之一,研究发现,胰腺癌细胞中NF-B分子一直处于活化状态, NF-B的组成型激活在胰腺癌的发生发展中起关键作用。LDM能够抑制胰腺癌细胞和肿瘤组织中K-ras mRNA和蛋白的表达水平,并且随着LDM作用浓度的提高,抑制作用越来越明显,呈现一定的剂量效应关系;而且,LDM也能抑制胰腺癌细胞中Akt的磷酸化,剂量依赖性地降低NF-B的蛋白表达水平,因此,LDM在胰腺癌细胞中可能通过K-ras/Akt信号转导途径下调NF-B蛋白在细胞中的表达水平,细胞中总