烟草内生芽孢杆菌降低烟叶亚硝胺类物质含量的研究

1、3. 烟草内生芽孢杆菌降低烟叶亚硝胺类物质含量的研究(云南省烟草科学研究所，玉溪市，653100 雷丽萍摘要：从白肋烟TN90品种的主脉组织中分离到一株内生菌株WT。根据形态和生理生化特征进行鉴定。该菌株在TSA 培养基上菌落形态为白色，环状突起。对利福平和萘啶酮酸敏感。革兰氏阳性（G+）、催化酶活性，产生芽孢，可运动，杆状，具一定的碱性磷酸酶活性和一定的脲酶活性，鉴定为芽孢杆菌(Bacillussp.。在温室移栽时将该内生细菌接种于白肋烟TN90, 并在收获后喷施细菌悬液于烟叶表面，进行亚硝胺类物质的检测，结果表明：接种WT 可减少白肋烟TN90的亚硝胺组分，TSNA总量比对照减少，叶片组织

2、减少21.7%44.6%，主脉组织减少16.7%80%。整个根系接种可有效降低叶片和主脉组织内TSNA 总量（P0.05），分别降低了38.0%和80%。叶面喷施可使叶片组织内TSNA 总量降低44.6%，也明显影响叶片和主脉组织中NNN 含量，差异显著（P0.05）。对NAT 和NAB 含量的影响不显著。关键词：TSNA 烟草晾制 烟草内生细菌Reduction of tobacco specific nitrosamine in air-cured tobacco leaves bya bacterial endophyte(Bacillus sp.（Institute of Tobacc

3、o Science Research, Yuxi 653100）LEI LipingA putative tobacco bacterial endophyte, WT was isolated from Burley tobacco variety TN90, and it was characterized by morphological, physiological, and biochemical methods. The WT isolate formed circular, white, convex, raised colonies on tryptic soy agar me

4、dium that were extremely sensitive to rifampicin and nalidixic acid. It was Gram positive, catalase positive, spore-forming, motile rod, with limited alkaline phosphatase activity and limited nitrate-reducing ability. Identification of WT by substrate use patterns (BIOLOG was unsuccessful but the mo

5、st likely genus in which to place the isolate is Bacillus sp. . TN90 was grown in a greenhouse and at the transplant stage inoculated with isolate WT, which was unable to reduce NO3- to NO2-. The grown tobacco was air cured and an additional treatment in which WT was sprayed on leaf tissue was emplo

6、yed. The total nitrosamine content and the content of individual nitrosamines was, on average, lower in inoculated plants than in the control. Total nitrosamine content reduced 21.7% to 44.6% in lamina tissue and 16.7% to 80% in midrib tissue. In three inoculation methods, wholeroot inoculation coul

7、d effectively reduce nitromine content with the percentage 38.0% in lamina tissue and 80% in midrib tissue (P 0.05. And Sprayed plants were as effective at reducing nitrosamine content in lamina tissue as plants inoculated at transplanting with the percentage of 44.6%, and effectively reduced NNN co

8、ntent in lamina and midrib tissues(P 0.05, however, the reduction in NAT and NAB content was not statistically significant. Key words: TSNA, inoculation bacteria, Air cured tobacco, Endophytic bacteria亚硝胺是潜在的致癌物质，是烟草生长和晾制过程中受到关注的一项指标1。亚硝胺形成的前体物是烟草生物碱、硝酸盐和亚硝酸盐。大田正常生长及成熟的青烟不含，是采收后在调制、贮存陈化过程中逐步形成和积累起来的

9、。国内外研究报道亚硝胺的形成与烟草调制过程中烟草内部和烟草表面存在的细菌有关26，而能够将NO 3- 还原成NO 2-的细菌在TSNA 形成过程中起着重要作用1，因此通过调控烟草晾制过程中烟草表面的细菌种类和数量，减少TSNA 前体物质的形成，从而降低烟叶TSNA 含量，具有重要的理论和实际意义。本文作者分离到一株烟草内生芽孢杆菌，该菌株不具有硝酸还原酶活性，但可降低烟草调制过程中烟叶的TSNA 含量，现报道该菌株的分离鉴定以及对烟草调制过程中烟叶的TSNA 总量及各种组分的影响。 1. 材料和方法1.1烟草内生细菌的分离与鉴定GN 和GP 检测系统，对内生细菌进行鉴定。1.2 烟草内生细菌接

10、种白肋烟TN90后，对烟叶亚硝胺类物质含量的影响cfu/mL。设4个处理：用常规育种，不接种WT 为对照；用5ml 细菌悬浮液接种于整个根系；成苗后移栽在商售盆内。成苗时切断幼苗主根浸泡在细菌悬浮液中48小时后移栽在商售盆内。烟叶成熟收获时，叶表面喷WT 细菌悬浮液，晾制两周重复再喷一次。各处理成苗后所有植株都移栽到商售盆内，在温室栽培直到成熟。每处理4个重复。方法进行分析。所得数据采用SPSS 软件进行统计分析。 2. 结果采用 TSA培养基所分离到的一株内生细菌，其菌落形态为：白色、圆形、突起、边缘隆起光滑、表面湿润。该菌落生长于TSA 培养基上，通过在TSA 培养基中添加浓度达到10g/

11、ml的奈啶酮酸和利福平来检测其对抗生素的自发抗性，结果表明该菌株对奈啶酮酸和利福平非常敏感。对该内生细菌进行常规的革兰氏染色。当用3%KOH检测时，菌体在30s 之内能够拉起细线,且能水解LANA 产生黄色的为G -菌7。但WT 菌株在 30 s之内不能拉起细线，且不能水解LANA而产生黄色。通过在TSA 培养基中添加浓度为5g/mL和30g/mL的万古霉素检测其对抗生素的敏感性，结果表明该菌株对万古霉素敏感，而万古霉素可抑制G +细菌中肽聚糖的合成。根据以上实验结果证明该菌为G +菌。在对数生长期菌体为杆状，长约2-3m，在稳定期的菌体内有芽孢，并观察到该菌是可运动的。该菌适宜生长温度为28

12、-30，上限温度为42，当有H 2O 2存在时，不能形成O 2。在pH11时，可微弱水解PNP，表明其具有碱性磷酸酶活性。在Christen Urea 培养基上能够生长，表明该菌具脲酶活性。当在具NO 3-的TSA 上厌氧培养时，该菌不能够将NO 3-还原成NO 2-，表明它没有NO 3-还原能力或能力很弱（图1）。在TSA 斜面上培养时，能使斜面变黄，表明在好氧条件下可水解葡萄糖、蔗糖或乳糖产生酸。在厌氧发酵时，无气体产生，也不能还原硫代硫酸盐产生H 2S。 这些特性说明该菌不可能是肠道微生物或大肠菌类。图1 内生细菌对硝酸盐还原作用GN 和GP 检测板对该菌进行了研究。当接种该细菌并培养2

13、4-48小时后，底物上可见透明的和无色的、浅兰色的、兰色、粉红色的显现，将该结果输入数据库中进行分析比较，由于数据库中程序限制，内存小，经多次验证结果GP 和GN板中结果见表1和表2。说明该体系中没有数据与该菌的结果相符。Table 1. Substrate use on BIOLOG GP plates bythe WT isolate (+/- refers to substrate use.CarbohydratesUseCarboxylic acidsUseAmino acidsUse N-Acetyl-D-glucosamin e+ Acetic acid - D-Alanine -

14、 N-Acetyl-D-mannosami ne + D-Galacturonic acid + L-Alanine - Amygdalin - D-Gluconic acid + L-Alany-glycine - Arabinose + a-Hydroxybutric acid - L-Asparagine + Cellobiose + b-Hydroxybutric acid - Alaninamide - D-Arabitol - g-Hydroxybutric acid - L-Glutamic acid+ D-Fructose + p-Hydroxyphenylacetic aci

15、d - N-Acetyl-L-Glutamic acid - L-Fucose - Saficin+ Glycyl-L-glutamic acid - D-Galactose + a-Ketobutyric acid + Adenosine + Gentiobiose+ a-Ketovaleric acid- 2-Deoxyadenosine-a-D-Lactose + Propionic acid- 3-Methyl-Glucose- Lactulose - D-Malic acid - L-Pyroglutamic acid - Maltose +L-Malic acid +a-Methy

16、l-D-Glucoside - D-Mannitol + Pyruvic acid + L-Serine+ D-Mannose + Succinic acid + b-Methyl-D-Glucoside + D-Melibiose - a-Methyl-D-Mannoside - D-PsicoseD-Raffinose + 2,3-Butanediol - L-Rhamnose + Glycerol - Inosine - D-Sorbitol +Thymidine - Sucrose + EstersUridine + D-Trehalose + Mono-methylsuccinate

17、 +Turanose - Methylpyruvate + Xylitol - Putrescine -ArbutinMaltotriose + Glycogen Stachyose + a-Cyclodextrin + Succinamic acid - D-Tagatose - Dextrin + Lactamide - Sedoheptulosan - Tween 80 -Palatinose - Tween 40 D-Melezitose + Mannan - D,L-a-Glycerol phosphate - L-Mannose + Inulin - Glucose-1-phosp

18、hate + D-Xylose+Glucose-6-phosphate+Table 2. Substrate use on BIOLOG GN plates bythe WT isolate (+/- refers to substrate use.CarbohydratesUseCarboxylic acidsUseAmino acidsUse N-Acetyl-D-galactosamine - Acetic acid - D-Alanine + N-Acetyl-D-glucosamine + cis-Aconitic acid + L-Alanine + Adonitol - Citr

19、ic acid + L-Alany-glycine - L-Arabitol - Formic acid + L-Asparagine + Cellobiose + D-Galactonic acid lactone + L-Aspartic acid + I-Erythritol - D-Galacturonic acid+ L-Glutamic acid+ D-Fructose + D-Gluconic acid + Glycyl-L-aspartic acid - L-Fucose -D-Glucosaminic acid-Glycyl-L-glutamic acid- D-Galact

20、ose + D-Glucoronic acid + L-Histidine + Gentiobiose + a-Hydroxybutric acid - Hydroxy-L-proline a-D-Glucose + b-Hydroxybutric acid + L-Leucine + m-Inositol + g-Hydroxybutric acid - L-Ornithine - a-D-Lactose + a-Hydroxyphenylacetic acid - L-Phenylalanine- Lactulose - Itaconic acid + L-Proline + Maltos

21、e+a-Ketobutyric acid-L-Pyroglutamic acid+D-Melibiose + D,L-Lactic acid + L-Threonine - D-Psicose + Malonic acid - D,L-Carnitine + D-Raffinose +Propionic acid+g-Aminobutyric acid+ L-Rhamnose + Quinic acid +D-Sorbitol + D-Saccharic acid Sucrose + Sebacic acid - Inosine + D-Trehalose + Succinic acid +

22、Urocanic acid - Turanose +Thymidine - Xylitol Uridine +Succinamic acid - Glucuronamide - AminesMono-methylsuccinate + Alaninamide - Phenylethylamine - Methylpyruvate + 2-Aminoethanol -Phosphorylated chemicalsPutrescine+ Polymers D,L-a-Glycerol phosphate + Glycogen + Glucose-1-phosphate a-Cyclodextri

23、n - Glucose-6-phosphate + 2,3-Butanediol - Dextrin + Glycerol + Tween 80 - Tween 40-TSNA 主要由4种成份组成，即N-亚硝基去甲基烟碱（NNN），4-（N-甲基-亚硝胺）-1-丁酮（NNK），N-亚硝基新烟草碱（NAT），N-亚硝基假木贼喊（NAB）。其中主要成份是NNN 和NAT。采用细菌悬液浸泡整个根系、切根后浸泡以及收获后叶面喷施三种不同方式将内生细菌接种于烟草TN90，晾晒后检测叶片组织中TSNA、NNN、NAT和NAB 的含量，结果表明三种接种方式中叶片组织的TSNA 含量、NNN、NAT和NAB

24、的含量都低于对照见表3。其中以细菌悬液浸泡整个根系以及烟叶表面喷洒细菌悬液的接种处理后，烟草叶片组织内TSNA 总明显降低，分别降低了38.0%和44.6%，与不接种细菌的空白对照处理相比，差异显著（P 0.05），但这两种处理方式之间差异不显著。移栽期切根处理对叶片组织中TSNA 含量的影响不显著。三种接种方式中叶面喷施细菌悬浮液可明显降低烟草叶片组织内的NNN 含量，比空白对照降低了57.1%，差异显著（P 0.05），但其他2种接种方式也使NNN 含量降低，但与对照比较，差异不显著。三种接种方式可降低叶片组织内NAT+NAB的含量，但与对照比，差异不显著。而对于烟叶内含量较低的NNK，经

25、上述三种方式处理后，组织内NNK 的降低百分率分别达到了25.0%90.0%，与对照相比，差异显著（P 0.05）。表3: 接种内生细菌WT 后对叶片组织中TSNA（g/g）含量的影响 （P 0.05）的含量。也可能由于内生细菌产生的抗生物质而使得调制过程中微生物的数量得到控制而使 TSNA 含量降低。叶面喷施内生芽孢杆菌 WT 可降低叶片 TSNA 含量的机理可能也是由于 WT 的快速 繁殖，与硝酸盐还原细菌的生态位竞争，降低了叶片表明微生物的数量，而使 TSNA 含量降低。 也可能存在 WT 本身对亚硝胺类物质的降解。关于其作用机理还有待于深入研究。 参考文献 1 Hecht S S. B

26、iochemistry, biology and carcinogenicity of tobacco specific . N-nitrosamines. Chem. Res. Toxicol. 1998,11:559-603. 2 Persons L L, Smith M S ; Hamilton J L et al. Nitrate reduction during curing and processing of Burley tobacco. Tob.Science., 1986, 30:48-51. 3 Bush L P, Hamilton J L and Davis D L.1979