温度和培养基在申克孢子丝菌酵母相转化中的作用研究

1、温度和培养基在申克孢子丝菌酵母相转化中的作用研究         11-03-31 16:28:00     编辑：studa20             作者：张静， 黄怀球， 薛汝增 张晓辉 冯佩英 李美荣【摘要】  【目的】 探讨不同温度和培养基在申克孢子丝菌酵母相转化中的作用。【方法】 将4株临床分离菌株分别接种于SDA、PDA、BHI、5

2、0 mg/kg羊血BHI及5 mg/kg GSBHI 5种培养基平皿上，每种培养基接种5个平皿，分别置于25 、35 、36 、37 及38 含体积百分数为5%CO2的恒温箱中培养。观察菌落生长情况并计算酵母细胞转化率。【结果】 在38 ，平皿转化率为25%(只有1株菌发生了转化);在35 和37 时，平皿转化率分别是60%和85%;而在36 时平皿转化率仅为45%。使用50 mg/kg羊血BHI和0.5%GSBHI培养基培养，65%培养皿上的菌株发生了酵母相转化，使用BHI培养基培养，45%培养皿上的菌株发生了酵母相转化，而使用SDA和PDA培养基培养，只有20%培养皿上的菌株发生了酵母相转

3、化。37 时，有3株菌在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培养基上的酵母细胞转化率均达到90%，1株菌在SDA、PDA和BHI培养基上的转化率均低于10%。【结论】 温度是影响申克孢子丝菌酵母相转化的关键因素，培养基的营养成分亦是影响转化效果的重要因素。 【关键词】  申克孢子丝菌; 酵母相转化; 温度; 培养基Abstract： 【Objective】 To investigate the effect of temperature and media on mycelium-to-yeast transformation of Sporothrix s

4、chenckii. 【Methods】 The clinical isolates 4 were inoculated on plates of media after reactivation. Each isolate was inoculated on plates of SDA， PDA， BHI， 50 mg/kg goat blood BHI and 5 mg/kg GSBHI， and 5 plates of each media were prepared because isolates of each meida were incubated at 25 ， 35 ， 36

5、 ， 37 ， and 38 . Growth of Sporothrix schenckii was observed and rates of transformation were calculated. 【Results】 At 38 ， the transformations rates were 25%(the only one Strain converted yeast). At 35 and 37 ， the transformations rates were 60% and 85%， respectively. At 36 ， the transformations ra

6、tes were 45%. There were 13 of 20 plates converting yeast when 5% goat blood BHI and 0.5%GSBHI were used， 9 of 20 plates when BHI was used， 4 of 20 plates when SDA and PDA were used. At 37 ， transformation rates of 3 isolates reached 90% on medium of BHI， 50 mg/kg goat blood BHI和5 mg/kg GSBHI; Howev

7、er， the transformation rates of 1 isolate were less than 10% on SDA， PDA， and BHI. 【Conclusion】 Temperature is the key factor that affects mycelium-to-yeast transformation of Sporothrix schenckii， nourishments of media may also be necessary for transformation.申克孢子丝菌属于双相型真菌，在自然界或室温培养为菌丝相，在体内或37 培养为酵母

8、相。申克孢子丝菌感染可导致孢子丝菌病，不仅可以引起皮肤组织的病变，还可侵犯内脏器官引起系统性病变，严重危害着人类的健康1-2。酵母相是申克孢子丝菌的致病相，申克孢子丝菌在体内从菌丝相到酵母相的转化是致病的一个关键步骤3-4。目前关于酵母相转化的研究多集中在基因水平5-6，而对于与致病性同样紧密相关的生化特点研究较少。本文研究了不同温度和培养基在申克孢子丝菌酵母相转化中的作用。1 材料与方法1.1 实验菌株菌株SUMS0382、SUMS0383、BMU02035和BMU00471经形态学和分子生物学鉴定为申克孢子丝菌。SUMS0382和SUMS0383分离自我科淋巴管型孢子丝菌病患者，BMU02

9、035和BMU00471由北京大学真菌和真菌病研究中心惠赠，亦分离自孢子丝菌病患者。1.2 培养基沙堡弱琼脂(Sabouraud?蒺s agar， SDA)基、马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar， PDA)基、脑心浸汁琼脂(brain heart infusion agar， BHI)基、含50 mg/kg去纤维蛋白羊血清的脑心浸汁琼脂基(brain heart infusion agar plus 50 mg/kg goat blood， 50 mg/kg羊血BHI)及含5 mg/kg葡萄糖脑心浸汁琼脂基(brain heart infusion agar plus

10、5 mg/kg Glucose， 5 mg/kg GSBHI)，pH值均为7.0，购自广州市迪景微生物技术有限公司。1.3 菌株活化将实验菌株接种于 PDA 斜面培养基上，在含体积分数为5%的CO2 25 恒温箱中培养，每隔7 d传代1次，连续传代2次，光镜下检查菌落形态，以保证菌株的纯度和生长活力。1.4 酵母相转化于超净工作台内，采用划线接种法将每株菌分别接种于SDA、PDA、BHI、50 mg/kg羊血BHI及5 mg/kg GSBHI 5种培养基上，每种培养基接种5个平皿，分别置于25、35、36、37及38 含5%的体积分数为CO2恒温温箱中培养。观察菌落生长情况，每5 d传代1次，

11、连续传代3次。在所有平皿上的菌株传代3次生长至第5天时，用接种环挑取少量菌落，置于灭菌载玻片上，滴加乳酸酚棉兰或酚红染色后，置于光学显微镜下观察菌落形态。参照文献7计算每个平板上菌株的酵母细胞转化率，转化率 > 10%为酵母相转化成功。1.5 统计学分析利用精确概率法对所有菌株在不同温度和培养基下转化率的差异进行统计学分析，统计软件使用SPSS 16.0， P < 0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 菌株活化4 株申克孢子丝菌经活化后均生长良好，形成棕褐色有皱褶的典型菌落。2.2 酵母相转化在25 的培养条件下，5种培养基上生长的菌株均表现为明显的丝状菌落，不能转化为酵母

12、相。在38 时，25%培养基平皿上的菌株发生了酵母相转化(为菌株BMU00471，其余菌株均不能生长)。35 和37 时分别有60%(12/20)和85%(17/20)培养基平皿上的菌株发生了酵母相转化。36 时仅有45%(9/20)培养基平皿上的菌株发生了酵母相转化(表1)。菌株在各温度下的转化率的差异具有统计学意义(P < 0.001)。在光镜下计数不同温度时50 mg/kg羊血BHI培养基上生长的4株申克孢子丝菌酵母细胞的转化率，发现所有菌株在35 和37 的转化率均明显高于36 和38 ，对于菌株BMU00471，其在35 和37 的转化率均可达到90%;38 时所有菌株的转化率

13、最低，菌株SUMS0382、SUMS0383、BMU02035均低于10%(图1)。不同温度下的酵母相菌落均在转种后的第2天开始出现，在第2 4天生长迅速，在第5天生长变得缓慢。在含5%去纤维蛋白羊血清的BHI培养基上，菌株BMU00471在35、36、37和38 均可以转化为酵母相。在35 和37 时，酵母细胞生长良好，光镜下观察发现90%的菌丝可转化为酵母细胞;在36 ，酵母相菌株生长相对缓慢，光镜下仍可见到较多的菌丝片段和孢子;在38 ，菌株生长速度较36 时快，但在光镜下发现转化的酵母细胞数量较36 少(图2)。     11-03-31 16:

14、28:00     编辑：studa20在营养丰富的50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培养基平皿上，酵母相转化率均为65%，且生长最为旺盛;BHI培养基次之为45%;SDA和PDA培养基最少均为20%，且菌株在不同培养基上的转化率的差异具有统计学意义(P = 0.002，表2)。35 时，在SDA和PDA培养基上菌株以菌丝相生长，而在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培养基上则以酵母相生长。36 时，在SDA和PDA培养基上菌株不能生长，在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培养基

15、上则以酵母相生长。37 时，菌株SUMS0382、BMU02035和BMU00471在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培养基上的酵母细胞转化率均达到90%;菌株SUMS0383在SDA、PDA和BHI培养基上的转化率均低于10%(图3)。不同培养基上的酵母相菌落均在转种后的第2天开始出现，在第2 4天生长迅速，在第5天生长变得缓慢。 在35 时，菌株BMU00471在BHI、50 mg/kg羊血BHI及5 mg/kg GSBHI培养基上均可转化为酵母相，且生长良好，光镜下观察可见转化良好的呈“雪茄”样的酵母细胞(图4);而在SDA及PDA培养基上，菌株BMU004

16、71呈现不典型的丝状菌落，并可产生棕色色素，光镜下可见大量的菌丝及“梅花”样孢子(图4)。3 讨 论本研究发现在36 时4株申克孢子丝菌临床分离株均可以转化为酵母相，而在以往仅Lima等8报道1株申克孢子丝菌在动物体内传代以后才具备在36 发生酵母相转化的能力。在我们的研究中，36 时有45%培养基平皿上的申克孢子丝菌发生了酵母相转化，但其酵母细胞转化率明显低于35 和37 时的转化率。36 时菌株转化数量及转化率却同时低于35 和37 ，其内在机制在进一步研究中。本研究发现，35 和37 是申克孢子丝菌酵母相转化的适宜温度，与以往的研究相符7。在35 和37 ，无论是发生转化的菌株数量还是酵

17、母细胞的转化率，均明显高于36 和38 。但35 和37 哪个更适合申克孢子丝菌的酵母相转化呢?我们的研究显示，在37 而不是35 ，发生酵母相转化的菌株数量最多，酵母细胞转化率最高，与Dixon等7研究显示的35 适合申克孢子丝菌环境分离株的酵母相转化，而37 适合临床分离株的转化现象一致。也有学者发现分离自固定型孢子丝菌病的菌株只能在35 发生酵母相转化，分离自淋巴管型孢子丝菌病的菌株无论在35 还是37 均可发生酵母相转化9。本研究中分离自皮肤淋巴管型孢子丝菌病患者的菌株SUMS0382和SUMS0383，既可在35 也可在37 发生酵母相转化。在38 仅菌株BMU00471可以转化为酵

18、母相，其余菌株不能生长。Ghosh等10的研究显示申克孢子丝菌在30 37 生长良好，在40 生长受到了抑制，并没有明确指出在38 申克孢子丝菌是否能够生长和发生转化。有学者证明钙调蛋白激酶可以调控申克孢子丝菌从菌丝相到酵母相的转化4。我们推测温度在申克孢子丝菌酵母相转化过程中的作用可能与钙调蛋白激酶的活性有关。本研究首次发现在临床常使用的PDA和SDA培养基上，申克孢子丝菌可以转化为酵母相，然而营养丰富的BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培养基上发生酵母相转化的申克孢子丝菌数量和酵母细胞的转化率明显高于PDA和SDA培养基，可见营养成分是影响申克孢子丝菌酵母相转化

19、的重要条件。以往文献10-12报道申克孢子丝菌的酵母相转化使用的培养基有胱氨酸葡萄糖血琼脂基、BHI、含50 mg/kg去纤维蛋白羊血的BHI和胰蛋白酶大豆琼脂基，均可获得较好的转化率，我们利用含5 mg/kg葡萄糖的BHI培养基对申克孢子丝菌进行酵母相转化，其转化菌株的数量和酵母细胞转化率与含50 mg/kg去纤维羊血BHI培养基的一致，值得在临床推广。研究显示不同培养基上的酵母相菌落均在转种后的第2天开始出现，在第2 4天生长迅速，在第5天生长变得缓慢，与Robert13在电镜下观察到的时间一致。但Hempel14将豚鼠的外周巨噬细胞加入培养基中，可将申克孢子丝菌酵母细胞的转化时间缩短至2

20、4 h。总之，本研究通过探讨不同温度和培养基在申克孢子丝菌酵母相转化中的作用，明确了温度是影响申克孢子丝菌酵母相转化的关键因素，培养基的营养成分亦是影响转化效果的重要因素，从而进一步证实了申克孢子丝菌酵母相转化条件的多样性，为抑制申克孢子丝菌在体内的酵母相转化，阻断其致病机制提供了研究基础。【参考文献】  Agarwal S， Gopal K， Umesh， et al. Sporotrichosis in Uttarakhand (India)： a report of nine cases J. Int J Dermatol， 2008， 47(4)： 367-371.Ramos

21、-e-Silva M， Vasconcelos C， Carneiro S， et al. Sporotrichosis J. Clin Dermatol， 2007， 25(2)： 181-187.Toledo MS， Levery SB， Straus AH， et al. Dimorphic expression of cerebrosides in the mycopathogen Sporothrix schenckii J. J Lipid Res， 2000， 41(5)：797-806.Aquino-Pinero E， Rodriguez-del Valle N. Charac

22、terization of a protein kinase C gene in Sporothrix schenckii and its expression during the yeast-to-mycelium transitionJ. Med Mycol， 2002， 40(2)： 185-199.Valentin-Berrios S， Gonzalez-Velazquez W， Perez-Sanchez L， et al. Cytosolic phospholipase A2： a member of the signalling pathway of a new G prote

23、in alpha subunit in Sporothrix schenckiiJ. BMC Microbiol， 2009， 9： 100.Valle-Aviles L， Valentin-Berrios S， Gonzalez-Mendez RR， et al. Functional， genetic and bioinformatic characterization of a calcium/calmodulin kinase gene in Sporothrix schenckii J. BMC Microbiol， 2007， 7： 107.Dixon DM， Salkin IF，

24、 Duncan RA， et al. Isolation and characterization of Sporothrix schenckiifrom clinical and environmental sources associated with the largest U.S. epidemic of sporotrichosis J. J Clin Microbiol， 1991， 29(6)： 1106-1113.Lima RF， Santos Brito MM， Schaffer GM， et al. Evaluation of the in vitro and in viv

25、o dimorphism of Sporothrix schenckii， Blastomyces dermatitidis， and Paracoccidioides brasiliensis isolates after preservation in mineral oil      11-03-31 16:28:00     编辑：studa20在营养丰富的50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培养基平皿上，酵母相转化率均为65%，且生长最为旺盛;BHI培养基次之为45%;SDA和PDA培养

26、基最少均为20%，且菌株在不同培养基上的转化率的差异具有统计学意义(P = 0.002，表2)。35 时，在SDA和PDA培养基上菌株以菌丝相生长，而在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培养基上则以酵母相生长。36 时，在SDA和PDA培养基上菌株不能生长，在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培养基上则以酵母相生长。37 时，菌株SUMS0382、BMU02035和BMU00471在BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培养基上的酵母细胞转化率均达到90%;菌株SUMS0383在SDA、PDA和BHI培养基上的转化

27、率均低于10%(图3)。不同培养基上的酵母相菌落均在转种后的第2天开始出现，在第2 4天生长迅速，在第5天生长变得缓慢。 在35 时，菌株BMU00471在BHI、50 mg/kg羊血BHI及5 mg/kg GSBHI培养基上均可转化为酵母相，且生长良好，光镜下观察可见转化良好的呈“雪茄”样的酵母细胞(图4);而在SDA及PDA培养基上，菌株BMU00471呈现不典型的丝状菌落，并可产生棕色色素，光镜下可见大量的菌丝及“梅花”样孢子(图4)。3 讨 论本研究发现在36 时4株申克孢子丝菌临床分离株均可以转化为酵母相，而在以往仅Lima等8报道1株申克孢子丝菌在动物体内传代以后才具备在36 发生

28、酵母相转化的能力。在我们的研究中，36 时有45%培养基平皿上的申克孢子丝菌发生了酵母相转化，但其酵母细胞转化率明显低于35 和37 时的转化率。36 时菌株转化数量及转化率却同时低于35 和37 ，其内在机制在进一步研究中。本研究发现，35 和37 是申克孢子丝菌酵母相转化的适宜温度，与以往的研究相符7。在35 和37 ，无论是发生转化的菌株数量还是酵母细胞的转化率，均明显高于36 和38 。但35 和37 哪个更适合申克孢子丝菌的酵母相转化呢?我们的研究显示，在37 而不是35 ，发生酵母相转化的菌株数量最多，酵母细胞转化率最高，与Dixon等7研究显示的35 适合申克孢子丝菌环境分离株的

29、酵母相转化，而37 适合临床分离株的转化现象一致。也有学者发现分离自固定型孢子丝菌病的菌株只能在35 发生酵母相转化，分离自淋巴管型孢子丝菌病的菌株无论在35 还是37 均可发生酵母相转化9。本研究中分离自皮肤淋巴管型孢子丝菌病患者的菌株SUMS0382和SUMS0383，既可在35 也可在37 发生酵母相转化。在38 仅菌株BMU00471可以转化为酵母相，其余菌株不能生长。Ghosh等10的研究显示申克孢子丝菌在30 37 生长良好，在40 生长受到了抑制，并没有明确指出在38 申克孢子丝菌是否能够生长和发生转化。有学者证明钙调蛋白激酶可以调控申克孢子丝菌从菌丝相到酵母相的转化4。我们推测

30、温度在申克孢子丝菌酵母相转化过程中的作用可能与钙调蛋白激酶的活性有关。本研究首次发现在临床常使用的PDA和SDA培养基上，申克孢子丝菌可以转化为酵母相，然而营养丰富的BHI、50 mg/kg羊血BHI和5 mg/kg GSBHI培养基上发生酵母相转化的申克孢子丝菌数量和酵母细胞的转化率明显高于PDA和SDA培养基，可见营养成分是影响申克孢子丝菌酵母相转化的重要条件。以往文献10-12报道申克孢子丝菌的酵母相转化使用的培养基有胱氨酸葡萄糖血琼脂基、BHI、含50 mg/kg去纤维蛋白羊血的BHI和胰蛋白酶大豆琼脂基，均可获得较好的转化率，我们利用含5 mg/kg葡萄糖的BHI培养基对申克孢子丝菌

31、进行酵母相转化，其转化菌株的数量和酵母细胞转化率与含50 mg/kg去纤维羊血BHI培养基的一致，值得在临床推广。研究显示不同培养基上的酵母相菌落均在转种后的第2天开始出现，在第2 4天生长迅速，在第5天生长变得缓慢，与Robert13在电镜下观察到的时间一致。但Hempel14将豚鼠的外周巨噬细胞加入培养基中，可将申克孢子丝菌酵母细胞的转化时间缩短至24 h。总之，本研究通过探讨不同温度和培养基在申克孢子丝菌酵母相转化中的作用，明确了温度是影响申克孢子丝菌酵母相转化的关键因素，培养基的营养成分亦是影响转化效果的重要因素，从而进一步证实了申克孢子丝菌酵母相转化条件的多样性，为抑制申克孢子丝菌在

32、体内的酵母相转化，阻断其致病机制提供了研究基础。【参考文献】  Agarwal S， Gopal K， Umesh， et al. Sporotrichosis in Uttarakhand (India)： a report of nine cases J. Int J Dermatol， 2008， 47(4)： 367-371.Ramos-e-Silva M， Vasconcelos C， Carneiro S， et al. Sporotrichosis J. Clin Dermatol， 2007， 25(2)： 181-187.Toledo MS， Levery SB， Straus AH， et al. Dimorphic expression of cerebrosides in the mycopathogen Sporothrix schenckii J. J Lipid Res， 2000， 41(5)：797-806.Aquin