紫苏提取物对化学性肝损伤保护作用的研究

1、营养学报2009年第31卷第3期 277紫苏提取物对化学性肝损伤保护作用的研究王 虹，顾建勇1，白少进2，刘 敏3(泰山医学院化学与化学工程学院，泰安 271016；1泰安大凡神农制药公司, 泰安 271600；2肥城矿业集团兴杨公司职工医院内科，肥城 271601；3泰安市中心医院妇科, 泰安 271000)【摘 要】目的 研究紫苏提取物(Perilla frutescens extract, PE)对急性化学性肝损伤的保护作用。方法 80只雄性KM小鼠(体重20±2 g)随机分为组：正常对照组(NC)，模型对照组(MC)，阳性药联苯双酯(DDB)组(200mg/kg)，迷迭香酸(

2、rosmarinic acid, RAD)低、高剂量预防组(11、44 mg/kg)，PE低、中、高剂量预防组(30、60、120 mg/kg)。NC、MC组灌胃生理盐水,其它各组灌胃同等容量的相应药物，每天给药1次。实验20 d后，用四氯化碳（CCl4 0.05 ml/kg）和乙酰氨基酸（APAP 250 mg/kg）腹腔注射分别制作急性化学性肝损伤模型。测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性、甘油三酯(TG)含量，肝组织匀浆超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)含量，并AST观察肝脏病理改变。结果 PE (120 mg/kg) 能

3、显著降低CCl4与APAP诱导的肝损伤小鼠血清ALT、活性、TG含量，升高肝脏SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量能明显减轻肝组织损伤程度；PE对正常小鼠血清ALT、AST、TG无影响。结论 PE对CCl4或APAP诱导的小鼠急性化学性肝脏氧化损：277280 伤具有显著保护作用。营养学报，2009，31（3）关键词： 紫苏提取物；四氯化碳；对乙酰氨基酚；急性化学性肝损伤中图分类号： R285.5 文献标识码：A 文章编号：0512-7955（2009）03-0277-04STUDY ON THE PROTECTIVE EFFECT OF PERILLA FRUTESCENS EXTRAC

4、TON CHEMICAL LIVER INJURY IN MICEWANG Hong，GU Jian-yong1，BAI Shao-jin2, LIU Min3( Department of Chemistry and Chemical Engineering, Taishan Medical College, Taian 271016；1Taian Dafanshennong Pharmaceutical Co.,LTD,Taian 271600；2Workers' Hospital of Xingyang Company, Feicheng Mining Group Corp, F

5、eicheng 271601；3Department of Gynecology, Taian Central Hospital, Taian 271000，China)【Abstract】 Objective To study the protective effect of Perilla frutescens extract (PE) on acute chemical liver injury in mice. Method Eighty mice were randomly divided into eight groups: normal control group (NC), m

6、odel control group (MC), positive control group treated with 200 mg/kg bifendate (DDB), prevention groups treated with 11 or 44 mg/kg rosmarinic acid (RAD), prevention groups treated with 30, 60, or 120 mg/kg PE. Normal saline was given to NC and MC group daily and the other groups were given corres

7、ponding drugs at the same volume and same way for successive 20d. The model of acute chemical liver injury was set up in mice respectively by carbon tetrachloride (CCl4) and acetaminophen (APAP) after last administration. The activities of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotran- sferase

8、 (AST), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), and the content of malondia- dehyde (MDA) and triglyceride (TG) were detected respectively in serum and liver. Results PE significantly reduced the activities of ALT, AST, level of TG in serum and level of MDA in liver, and increas

9、ed the activities of SOD, GSH-Px in liver in acute chemical liver injury induced by CCl4 and APAP. The pathologic changes in liver in PE groups were slighter than in MC group. Conclusion PE shows收稿日期 2008-07-27作者简介 王虹（1973-）,硕士，讲师，E-mail：wangh278 significant antioxidative effect in protecting acute

10、chemical liver injury induced by CCl4 and APAP in mice. ACTA NUTRIMENTA SINICA, 2009, 31(3):277280Key words：Perilla frutescens extract； carbon tetrachloride； acetaminophen； acute chemical liver injury紫苏(Perilla frutescens)系唇形科草本植物, 性温、味辛，有行气和中、镇痛、健胃、散1寒解表及解鱼蟹虫毒之功效,是卫生部首批颁2布的既药食两用的60种中药之一。紫苏提取物(PE)含有

11、多种化学成分,如紫苏醛(perillal- dehyde)、紫苏酮(perillaketone)、迷迭香酸(rosmarinic acid，RAD)等，是一种高效天然抗氧化剂,其中RAD清除体内自由基的活性极强。目前，对紫苏和RAD的研究主要在抗炎、抗病毒、3抑制肿瘤等方面，对其保肝作用研究相对较少，本研究旨在探讨PE及RAD对四氯化碳(CCl4)或乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)诱导的急性化学性肝损伤的保护作用与机制。1 材 料 与 方 法41.1 PE制备称干燥紫苏叶，按40:1加水，在90水浴中浸提45 min，2次，用纱布粗滤；合并浸提液，用18% HCl调pH值2.

12、02.5，进行抽滤；将清液用乙酸乙酯（溶剂比1:2）萃取3次，合并萃取液，旋转蒸发除去乙酸乙酯，浓缩液经真空干燥制得PE。经泰山医学院分析测试中心高效液相色谱法测定，PE中RAD含量为37%（质量比）。 1.2 试剂与仪器RAD(分析纯)：南京青泽医药科技开发公司产品，纯度98%(HPLC法)；联苯双酯滴丸(北京协和药厂产品)；四氯化碳（分析纯，天津永大化学试剂开发中心产品）；APAP(山东博山制药公司产品)；丙二醛(MDA)检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒、天门冬氨酸氨基

13、转移酶（AST）试剂盒、甘油三酯（TG）试剂盒为中生北控生物科技公司产品；WFJ7200型紫外-可见分光光度仪(尤尼柯上海仪器公司)；VITROS 950全自动生化分析仪(Johnson & Johnson)。 1.3动物健康昆明种小鼠80只，体重20±2 g，雄性(中澳合资米歇尔生物制品公司动物中心提供)。饲养环境：温度(1825)，湿度40%60%，12h光照交替。 1.4方法小鼠适应性喂养1w后随机分为8组：正常对照(NC)组，肝损伤模型对照(MC)组，阳性药联苯双酯(DDB)组：200 mg/kg， RAD低(11 mg/kg)、RAD高剂量组(44 mg/kg)，P

14、E低(30 mg/kg)、PE中(60 mg/kg)和PE高剂量组(120mg/kg)。NC组和MC组灌胃10ml/kg生理盐水,其它各组灌胃等容量的相应药物。每天给药1次，连续20 d。 1.4.1 PE对正常小鼠的影响：取10只正常组小鼠设立为正常紫苏提取物(NC+PE)组，每日灌胃60 mg/kg PE，连续20d后处死动物取血清测ALT、AST活性和TG含量。1.4.2 CCl4肝损伤模型的制备：末次给药后，除NC组外，各组小鼠腹腔注射 0.5%的CCl4橄榄油溶液(10 ml/kg)制作急性肝损伤模型，NC组腹腔注射等量橄榄油。 1.4.3 APAP肝损伤模型的制备：末次给药后，除N

15、C组外，各组小鼠腹腔注射APAP(250 mg/kg bw)制作急性肝损伤模型，NC组注射等量生理盐水。 1.4.4 生化指标测定及病理观察：CCl4、APAP造模后禁食不禁水，各预防组小鼠于造模后6 h和12 h再分别给药一次，24 h后眼眶取血，离心制备血清。血清ALT、AST和TG均采用全自动生化分析仪测定。小鼠处死后取肝制备10%肝组织匀浆,离心取上清液，按试剂盒操作说明测定肝组织SOD、GSH-PX和MDA。取小鼠肝叶小块，生理盐水冲洗淤血，滤纸吸干水后置于10%的甲醛溶液中固定，制备病理组织切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察肝细胞损伤程度。 1.5 统计学处理采用SPSS 13.0

16、统计软件对实验数据进行单因素方差分析，两组间比较采用Dunnett-t检验。营养学报2009年第31卷第3期 2792 结 果2.1 PE对CCl4肝损伤小鼠血清ALT、AST和TG的影响(表1)伤模型造模成功。与MC组比，PE与RAD各剂量组 ALT、AST、TG明显降低(P0.05，P0.01)，且呈量效关系。Table 1 Effect of PE on ALT, AST and TG in serum of liver-injuried mice induced by CCl4 (±s，n =10)Dosage ALT AST TG (mg/kg) (U/L) (U/L) (

17、mmol/L)NC 37.77±10.56 61.67±17.37 0.49±0.12 NC+ PE 60 34.85±12.31 60.29±15.77 0.46±0.08 MC 200 1576.41±206.62a 1680.11±428.45a 1.26±0.30aDDB 200 530.70±145.85c 988.51±266.08c 0.52±0.16cL-PE 30 1224.32±310.53b 1468.59±222.72 0.73&#

18、177;0.12bM-PE 60 1100.56±282.43c 1314.35±319.37b 0.69±0.14bH-PE 120 952.15±195.53c 1042.66±202.45c 0.65±0.11cL-RAD 11 1265.01±218.73b 1497.30±305.75 0.78±0.02bH-RAD 44 980.82±282.24c 1093.27±178.84c 0.67±0.13cNC：normal control; NC+ PE：norma

19、l control+ Perilla frutescens extract; MC：model control; DDB：bifendate; L(M,H)-PE：low(middle, high) Perilla frutescens extract; L(H)-RAD：low(high) rosmarinic acid; a：P0.01 compared with normal group; b：P0.05, c：P0.01 compared with model group; the same in following tables. GroupTable 3 Effect of PE

20、on ALT, AST and TG in serum ofliver-injuried mice induced by acetaminophen(±s，n =10)GroupDosageALT AST TG(mg/kg)(U/L) (U/L) (mmol/L)NC 45.37±8.48 82.16±11.32 0.52±0.12aaMC 2001723.74±156.45 1908.87±413.26 1.38±0.31a DDB 200657.29±103.41c 848.37±196.68c 0.

21、61±0.25c L-PE 30 1265.01±218.73b 1497.30±305.75 0.96±0.07bcbbM-PE60 1100.56±282.43 1314.35±319.37 0.88±0.13cccH-PE120952.15±195.531042.66±202.45 0.78±0.11 L-RADH-RAD1.07±0.08b 11 1363.84±287.62b 1679.52±301.4944 980.82±282.24c1093

22、.27±178.84c 0.80±0.10c2.4 PE对APAP肝损伤小鼠肝组织SOD、GSH-Px和MDA的影响(表4)与NC组比，NC+PE组的ALT、AST和TG的变化无统计学意义(P0.05), 而MC组血清ALT、AST、TG 明显升高，差异显著(P0.01)，表明PE对正常动物无影响，CCl4急性肝损伤模型造模成功。与MC组比，PE与RAD各剂量组 ALT、AST、P0.01)，且呈量效关系。 TG显著降低(P0.05，2.2 PE对CCl4肝损伤小鼠肝组织SOD、GSH-Px和MDA的影响(表2)Table 4 Effect of PE on SOD, MD

23、A and GSH-Px in liver of liver-injuried mice induced by acetaminophen(±s，n =10)Group NC MC DDB L-PE M-PE H-PE L-RAD H-RADDosage SOD GSH-Px MDA (mg/kg)(U/mg) (U/mg) (nmol/mg) 186.57±29.31 120.18±23.54 4.31±0.28 200153.83±15.20a 96.34±12.75a 5.96±1.28a 200177.29±

24、;14.81c 113.47±20.36c 4.75±1.21c30 60 12011 44162.31±24.05 99.83±14.72 5.38±0.85b 170.54±22.34b 104.28±24.30b 5.15±0.26b 181.01±28.47c 108.51±27.24b 4.99±0.38b 158.52±20.11 98.39±17.65 5.52±0.22 175.17±23.60b 105.02±22.0

25、1b 5.08±0.17bTable 2 Effect of PE on SOD, MDA and GSH-Px inliver of liver-injuried mice induced by CCl4(±s，n =10)Group NC MC DDB L-PE M-PE H-PE L-RAD H-RADDosage SOD GSH-Px MDA (mg/kg) (U/mg) (U/mg) (nmol/mg) 192.31±25.14 113.18±26.43 4.25±0.33aa200 155.23±19.42 88.57&#

26、177;20.15 5.84±1.36a 200 184.41±18.27c 107.22±19.86c 4.67±1.20c 30 169.27±21.66 90.61±17.35 5.13±0.95b60 180.38±27.25b 96.73±21.28b 5.02±0.38b120 184.32±20.03c 102.35±28.24b 4.73±0.56c 11 160.46±22.27 90.84±26.52 5.20±0.

27、35b44 176.87±23.85b 100.32±20.64b 4.88±0.82c与NC组比，MC组肝脏SOD、GSH-Px活性显提示APAP著降低，MDA含量显著升高(P0.01)，损伤抗氧化系统，导致脂质过氧化。与MC组比，PE与RAD各剂量组SOD、GSH-Px活性均显著升高，MDA含量显著降低(P0.05，P0.01)，呈量效关系。2.5 PE对CCl4肝损伤小鼠肝脏形态学影响(图1)与NC组比，MC组肝脏SOD、GSH-Px活性显著降低，MDA含量显著升高(P0.01)，提示CCl4损伤了抗氧化系统，导致脂质过氧化。与MC组比，PE与RAD各剂量组

28、SOD、GSH-Px活性显著升高，MDAP0.01)，呈量效关系。 含量显著降低(P0.05，2.3 PE对APAP肝损伤小鼠血清ALT、AST和TG的影响(表3)与NC组比，MC组血清ALT、AST、TG 显著升高，差异显著(P0.01)，表明APAP急性肝损NC group MC groupDDB group PE group (high)28044 mg/kg)对两种肝损伤的保护作用均表现出近乎同等的等效性，组织形态学观察也显示二者对肝脏组织显微结构改善的程度和范围也基本相同。可见：RAD很可能是PE保肝最主要的有效成分。RAD group (high)参 考 文 献1 中药大辞典M.下

29、册.上海：上海人民出版社，1977，2356.2 全国中草药汇编编写组. 全国中草药汇编M. 下册. 北京：人民卫生出版社，1996，860865.Fig. 1 Hematoxylin eosin pathological section(×200)NC组肝组织结构完整，肝小叶轮廓清晰，肝细胞无变性、坏死；MC组肝小叶界限不清，细胞索紊乱，大部分肝窦消失，肝细胞广泛性的水样变性，肝小叶内有大片灶性坏死区，约占3/4；与MC组比，DDB组肝小叶结构清晰、完整，细胞索排列整齐，部分肝细胞轻度浊肿；PE组及RAD的高剂量组肝细胞中度浊肿，坏死灶减少，约占1/61/5，汇管区炎细胞浸润减轻，

30、范围减小。其它给药组肝组织损伤均有不同程度减轻，灶状坏死区大约占1/41/3，炎细胞浸润减轻等。3 讨 论RAD是一种强抗氧化性酚酸类化合物，其邻二酚羟基是清除自由基活性的物质基础，C3位的5共轭双键具有增效作用。RAD的抗氧化活性强6于咖啡酸、绿原酸、叶酸等，可能是PE 中存在的主要非酶抗氧化物质。据报道，外源性抗氧7化剂的补充对防治肝损伤起重要作用。目前关于RAD抗氧化性体外试验的研究报告，而关于PE和RAD在生物体中抗氧化能力的报道还很少。8CCl4和APAP肝损伤都是常用的肝炎模型。CCl4肝损伤的主要机制是形成的自由基引发脂质9过氧化反应。APAP肝损伤的机制是代谢产物干扰细胞内的能

31、量代谢使生物膜系统发生脂质过氧10化。在本试验中，口服PE和RAD均能明显降低CCl4、APAP肝损伤小鼠血清ALT、AST活性、TG含量，而PE对正常小鼠无影响，提示PE和RAD具有明显的肝脏保护作用。并且可能不是来源于PE对ALT、AST及TG的直接抑制。PE和RAD均能明显升高两种肝损伤小鼠肝组织SOD、GSH-Px活性，降低肝脏MDA含量，提示PE和RAD的保肝作用机制可能是因其能提高抗氧化能力，稳定肝细胞膜结构，减轻肝小叶结构的破坏，降低生物膜脂质过氧化的发生，从而降低血清中ALT、AST活性及TG水平。实验结果显示：含RAD等效剂量的PE预防组(PE：30,120 mg/kg)和RAD预防组(RAD：11和al.Rosmarinic 3 Osakabe N, Yasuda A, Natsume