实验五--微生物计数法及大小测定

1、实验五实验五 微生物的显微镜直接微生物的显微镜直接计数法和大小测定计数法和大小测定目的要求目的要求n了解血球计数板的构造、计数原理和计了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。n学习使用目镜测微尺和镜台测微尺在显学习使用目镜测微尺和镜台测微尺在显微镜下测定微生物大小的方法。微镜下测定微生物大小的方法。一、显微镜直接计数法一、显微镜直接计数法实验材料实验材料活材料：活材料： 酿酒酵母（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae）培养液。）培养液。其他器材：其他器材： 显

2、微镜、显微镜、血球计数板血球计数板、盖玻（盖玻（22mm22mm22mm22mm）、）、吸水纸、吸水纸、计数器计数器、滴、滴管、擦镜纸。管、擦镜纸。v显微镜直接计数法显微镜直接计数法是将小量待测样品的是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。的一种简便、快速、直观的方法。直接计数法优缺点直接计数法优缺点v优点：直观、快速、操作简单。优点：直观、快速、操作简单。v缺点：缺点：不能区分死菌与活菌，所得为总数；不能区分死菌与活菌，所得为总数；不适于对运动细菌的

3、计数。不适于对运动细菌的计数。实验原理实验原理常用计菌器常用计菌器v常用计数器有血球计数板常用计数器有血球计数板( (血细胞计数板血细胞计数板) )、Petroff-HauserPetroff-Hauser计菌器以及计菌器以及HawksleyHawksley计菌计菌器等。器等。v各种计数板的计数原理相同，只是血球计各种计数板的计数原理相同，只是血球计数板较厚，不能使用油镜观察，只能计数数板较厚，不能使用油镜观察，只能计数较大的霉菌孢子和酵母菌；而后两种计菌较大的霉菌孢子和酵母菌；而后两种计菌器细菌，可以使用油镜观察，因此可以直器细菌，可以使用油镜观察，因此可以直接计数细菌。接计数细菌。 血球计

4、数板血球计数板 Petroff-HauserPetroff-Hauser计菌器计菌器HawksleyHawksley计菌器计菌器 血球计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三血球计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网。的平台上各列有一个方格网。血球计数板的构造血球计数板的构造v每个方格网共分为九个大方格，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。中间的大方格即为计数室。v计数室的刻度一般有两种规格：计数室的刻度一般有两种规格：一种是一个大方格分成一种是

5、一个大方格分成2525个中方个中方格，而每个中方格又分成格，而每个中方格又分成1616个小个小方格；另一种是一个大方格分成方格；另一种是一个大方格分成1616个中方格，而每个中方格又分个中方格，而每个中方格又分成成2525个小方格。个小方格。v无论是哪一种规格的计数板，大方格（计数室）中的小方格无论是哪一种规格的计数板，大方格（计数室）中的小方格都是都是400400个。大方格边长为个。大方格边长为lmmlmm，则每一个大方格的面积为，则每一个大方格的面积为lmmlmm2 2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm0.lmm，所以计数，所以计数

6、室的容积为室的容积为0.lmm0.lmm3 3( (万分之一毫升万分之一毫升) )。A.25中格X16小格B.16中格X25小格计数方法计数方法v使用血球计数板计数时，使用血球计数板计数时，通常通常数数5 5个中方格个中方格的总菌数，的总菌数，然后求每个中方格的平均值，然后求每个中方格的平均值，再乘上大方格（计数室）中再乘上大方格（计数室）中方格的数量，就得出一个大方格的数量，就得出一个大方格中的总菌数。数两个大方格中的总菌数。数两个大方格总菌数，平均后，再换方格总菌数，平均后，再换算成每毫升菌液中微生物细算成每毫升菌液中微生物细胞的数量。胞的数量。酵酵母母个个体体形形态态制制备备适适当当浓浓

7、度度的的菌菌悬悬液液取取洁洁净净的的血血球球计计数数板板盖盖上上盖盖玻玻片片静静置置3至至5分分钟钟低低倍倍镜镜观观察察找找到到位位置置加加样样品品用用高高倍倍镜镜计计数数设设5个中方格的总菌数为个中方格的总菌数为A，菌液稀释倍数为，菌液稀释倍数为B计数板为计数板为25个中方格个中方格(本次试验本次试验) ：1ml菌液的总菌数菌液的总菌数=A/525104B计数板为计数板为16个中方格：个中方格：1ml菌液的总菌数菌液的总菌数=A/516104B实验步骤：酵母菌细胞总数的测定实验步骤：酵母菌细胞总数的测定用滴管由盖玻片边缘滴一小滴用滴管由盖玻片边缘滴一小滴( (不宜过多不宜过多) )，则菌液自

8、行渗，则菌液自行渗入，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。入，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。 注意事项注意事项n取样时先要摇匀菌液；取样时先要摇匀菌液；n加样时计数室不可有气泡；加样时计数室不可有气泡；n一般样品稀释度要求每小格内约有一般样品稀释度要求每小格内约有5-105-10个菌个菌体为宜；体为宜；n每个计数室选每个计数室选5 5个中格（个中格（4 4个角和中央）计数；个角和中央）计数；n位于格线上的菌体一般数上不数下，数右不位于格线上的菌体一般数上不数下，数右不数左；数左；n若芽体大小达到母细胞的一半，则作为两个若芽体大小达到母细胞的一半，则作为两个菌体计数。菌体计数。n血球计

9、数板使用完毕，用水冲洗干净，切勿血球计数板使用完毕，用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，以免损坏网格刻度；洗净后自用硬物洗刷，以免损坏网格刻度；洗净后自行晾干或吹风机吹干。行晾干或吹风机吹干。1ml菌液中的总菌数菌液中的总菌数= ？ 答案：答案：(3+4+4+3+2)525104 =8105个个/ml25中格中格X16小格小格二、微生物大小的测定二、微生物大小的测定实验材料实验材料活材料：活材料： 酿酒酵母（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae）培养液。）培养液。其他器材：其他器材：v显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺显微镜、目镜测微

10、尺、镜台测微尺目镜测微尺每格实际代表的长度随物镜的放大倍数而目镜测微尺每格实际代表的长度随物镜的放大倍数而改变，也会因使用不同的显微镜而产生误差，因此在改变，也会因使用不同的显微镜而产生误差，因此在使用前必须用镜台测微尺进行校正。使用前必须用镜台测微尺进行校正。 镜台测微尺镜台测微尺：中央部分刻有精确等分线的载玻片，将：中央部分刻有精确等分线的载玻片，将1mm1mm等分为等分为100100小格，每小格长小格，每小格长0.01mm0.01mm（即（即10m10m）。）。只用于校正目镜测微尺。只用于校正目镜测微尺。目镜测微尺目镜测微尺是可放入目镜内的圆形小玻片，精确等分为是可放入目镜内的圆形小玻片

11、，精确等分为5050小格或小格或100100小格。小格。实验原理实验原理目镜测微尺的校正：目镜测微尺的校正：目镜测微尺每格长度（目镜测微尺每格长度（m）=（两重合线间镜台测微尺（两重合线间镜台测微尺格数格数10）/两重合线间目镜测微尺格数两重合线间目镜测微尺格数 转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动载物台，使目镜测微尺的移动载物台，使目镜测微尺的0点与镜台测微尺的某点与镜台测微尺的某一刻度重合，然后，仔细寻找两尺第二个完全重合的一刻度重合，然后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度。刻度。目镜测微尺目镜测微尺镜台测微尺镜台测微尺l l 目

12、镜测微尺的标定目镜测微尺的标定 把目镜的上透镜旋开，将把目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺目镜测微尺轻轻放在目镜的轻轻放在目镜的隔板上，使隔板上，使有刻度的一面朝下有刻度的一面朝下。将。将镜台测微尺镜台测微尺放在显微镜放在显微镜的载物台上，使的载物台上，使有刻度的一面朝上有刻度的一面朝上。先用低倍镜观察，调。先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，并使两尺左边的微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，并使两尺左边的一条线重合，向右寻找另外一条两尺相重合的直线。一条线重合，向右寻找另外一条两

13、尺相重合的直线。 2 2用同法校正在高倍镜下目镜测微尺每格所量的载物台用同法校正在高倍镜下目镜测微尺每格所量的载物台上物体的实际长度。上物体的实际长度。 在高倍镜下（在高倍镜下（40 x）测定酵母菌的长和宽。）测定酵母菌的长和宽。选择有代表性的选择有代表性的10个细胞，个细胞，（估计小数点后面一位）估计小数点后面一位）思考题思考题n为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？n在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结