三七总苷对应激大鼠胃黏膜损伤及胃壁细胞超微结构的影响(一)

1、三七总苷对应激大鼠胃黏膜损伤及胃壁细胞超微结构的影响(一)    作者：邓响潮，李燕舞，王汝俊【摘要】 目的观察三七总苷对应激大鼠胃黏膜损伤及胃壁细胞超微结构的影响。方法采用经典的水浸-束缚应激模型,应激6 h后,大鼠处死剖腹取胃，肉眼计数各组胃黏膜糜烂、出血情况并计算溃疡指数（UI）；在透射电镜下观察各组胃黏膜壁细胞超微结构改变。结果肉眼观察正常对照组大鼠胃黏膜色泽红润，未见损伤性改变；模型组大鼠胃黏膜充血明显，腺胃部可见散在斑点状糜烂、出血，溃疡指数为（16.83±4.96）；与模型组相比，三七总苷组和雷尼替丁组胃黏膜充血减少，UI值均明显

2、下降(P0.01)。电镜下，正常对照组大鼠胃壁细胞分泌小管少见，呈现明显的静息状态，模型组分泌小管增多呈现泌酸激活状态；与模型组比较，三七总苷组分泌小管扩张不明显或明显塌陷，细胞内囊泡样结构增多；雷尼替丁组则见大量囊泡样结构，分泌小管明显减少。结论三七总苷可明显减轻应激对胃黏膜的损伤，还可促进胃黏膜壁细胞从激活状态向静息状态转化，说明三七总苷对应激大鼠胃黏膜具有保护作用，可能通过调控壁细胞的泌酸功能而发挥其抗应激性胃黏膜损伤作用。 【关键词】 应激性溃疡 胃黏膜损伤 溃疡指数 壁细胞 超微结构Abstract：ObjectiveTo observe the effect of total sa

3、ponins of Panax notognseng (PNS) on gastric mucosal lesion and ultrastructure of gastric mucosal parietal cells of stress rats. MethodsWater-immersion restraint stress (WRS)was used to induce rat models of stress. Six hours after WRS, the rats were executed to obtain the gastric tissue. The erosion

4、and hemorrhage of gastric mucosa in rats were observed by naked eyes, and then the ulceration index (UI) was calculated. The ultrastructure of gastric mucosal parietal cells in rats was observed under transmission electron microscope. ResultsThe results observed by naked eyes showed that no lesion w

5、as found in the normal group. However, in the model group, the gastric mucosal congestion was obvious, there existed scattered punctiform erosion and bleeding in the glandular stomach, and the UI was 16.83±4.96; compared with the model group, gastric mucosal congestion was reduced and UI decrea

6、sed in the PNS group and ranitidine group (P0.01). Under the electron microscope, there were less endocrine tubular villi in the parietal cells of the normal group, showing a static status. However, in the model group, the number of endocrine tubular villi increased, showing an activating status; co

7、mpared with the model group, the expansion of endocrine tubular villi was not obvious but the number of cytoplasm interior vesicles in parietal cells increased in PNS group, and in ranitidine group, the number of endocrine tubular villi was decreased and the number of vesicular structure was increas

8、ed.ConclusionPNS can reduce the stress-induced gastric mucosal lesion, and promote the wall cells of gastric mucosa transforming from the activated status into static status. The protective mechanism of PNS is probably related with the regulation of acid secretion of Parietal cell.Key words：Stress u

9、lcer; Gastric mucosal lesion; Ulceration index; Parietal cell; Ultrastructure应激状态下，由于损伤因子的攻击和防御作用的减弱，可出现下丘脑调控垂体等内分泌腺体功能障碍、胃黏膜微循环障碍、胃黏膜屏障受损、迷走神经兴奋性异常增高、壁细胞激活、胃黏膜内脂质过氧化物含量升高和氧自由基产生增加等多方面改变1。目前国内外对应激状态下壁细胞结构与功能变化的研究资料很少，三七总苷对应激大鼠壁细胞超微结构改变以及胃黏膜的保护作用也未见报道。本研究采用水浸-束缚应激的方法制作动物应激模型，观察应激大鼠胃黏膜损伤程度及胃壁细胞超微结构的变化

10、，探讨三七总苷对应激大鼠胃壁细胞超微结构的影响和对胃黏膜损伤的保护作用，为临床应用三七总苷防治应激性溃疡（SU）提供实验依据。1 器材1.1 试药三七总苷，购自云南植物药业有限公司，产品批号：200205086；规格：原料药，为淡黄无定形粉末；(Rb1+Rg1+R1)>60%,符合中国药典2000版规定标准。盐酸雷尼替丁胶囊，批号：H44021231，雅来（佛山）制药有限公司生产。1.2 试剂与仪器动物手术器械一套，大鼠应激笼，自制。青岛海尔冰箱、低温冰箱、电子天平，台式低温离心机（德国）；电热恒温水槽，上海医用恒温设备厂生产；721型可见光分光光度仪，上海第三分析仪器厂生产；高速内切式

11、组织匀浆机，上海金达生化仪器厂生产；微量加样器、冻存管、玻璃器皿等。恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器厂生产；电热恒温水浴箱，上海医疗器械五厂生产；H-800透射电镜，日本日立公司生产。2 方法2.1 动物分组与给药SPF级SD大鼠，36只，体重180220 g，雌雄各半，广州中医药大学实验动物中心提供，合格证书：SCXK（粤）2003-0002，粤监证字2007A004。实验前适应性饲养1周（温度2426。湿度60%70%）。上述动物随机分为正常对照组、SU模型组、三七总苷低、中、高3个剂量组及阳性药物（雷尼替丁）组。各组预防性灌胃给药或给同体积蒸馏水。2.2 试药剂量设计因临床成人静脉滴注络泰粉

12、针剂（三七总苷制剂）用量为200 mg/d/次，按成人60 kg体重计算，成人用药剂量为每日3.3 mg/kg。故大鼠给药按成人用量的5，10，20倍计算为16.5，33.0，66.0 mg/kg，即每千克体重给药16.5，33.0，66.0 mg;各组动物预定给药体积1 ml/100 g体重。三七总苷溶液配制：称取三七总苷粉末99 mg,加蒸馏水溶解（加20滴吐温20助溶），定容至60 ml,使终浓度为16.5 mg/ml；称取三七总苷粉末198 mg,加蒸馏水溶解（加20滴吐温20助溶），定容至60 ml,使终浓度为33.0 mg/ml；称取三七总苷粉末198 mg,加蒸馏水溶解（加20滴

13、吐温20助溶），定容至30 ml,使终浓度为66.0 mg/ml。2.3 应激实验方法采用经典的水浸-束缚应激模型1。三七总苷组预防性给药3 d，第3天末次给药后（包括阳性药雷尼替丁），大鼠禁食24 h、禁水1 h 后,将各组大鼠放入自制的应激笼中，头部朝上，固定四肢，然后将应激笼垂直放入恒温水槽中 (19 ±1)水浴,水面平胸骨剑突。持续时间6 h。水浸-束缚应激模型制作完成后，将所有大鼠分别拉颈处死，剖腹并游离胃。取下胃后，沿胃大弯剪开胃壁使黏膜面外翻，用冰冷生理盐水漂洗后，将胃黏膜面向上展平于洁净滤纸上，肉眼仔细计数腺胃区点线状糜烂、出血情况，按计数胃黏膜损伤溃疡指数。每组任选

14、3只大鼠，于腺胃前后壁中央处，剪取5mm大小的胃黏膜标本，用剃须刀片于电镜固定液4%多聚甲醛中切成1mm大小的组织数块，用于制作电镜标本。再用玻璃片刮下其余部分胃黏膜，放入冻存管内速冻，80冰箱保存。2.4 胃黏膜溃疡指数(UI)测定按Guth标准2计算溃疡指数(UI)。观察胃黏膜损伤的程度和形态。即点状病变为1分；病变长度1 mm为2分，12 mm为3分；24 mm为 4分；病变>4 mm为5分；病灶宽度>1 mm时分值×2。将所有分值相加即为此只大鼠胃黏膜UI，以下列公式计算出抑制百分率3。 抑制百分率（%）=对照组溃疡长度总和-实验组溃疡长度总和对照组溃疡长度总和&

15、#215;100%2.5 透射电镜标本制备取大鼠胃后,在垫有冰粒的平皿上，沿胃大弯剖开,迅速去除胃内容物,在胃窦部剪取5 mm×5 mm胃组织,并在生理盐水中冲洗干净, 于电镜固定液4%多聚甲醛中切成1 mm3大小的组织数块，置2.5%的戊二醛磷酸缓冲液中4下固定34 h，1%锇酸(OsO4)固定40 min，巴比妥缓冲液浸洗，梯度乙醇、丙酮脱水,无水乙醇与环氧树脂浸透、包埋,半薄切片定位。定位后将标本修成块状，超薄切片机将标本切成4060m厚的薄片，铜网捞片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色,电子显微镜观察并拍照。2.6 统计学分析应用 SPSS10.0统计软件进行分析，实验结果以

16、7;s表示，两组间比较采用t检验，P0.05为有显著性差异。3 结果3.1 应激大鼠胃黏膜损伤程度（溃疡指数）及胃黏膜大体观察 结果见表1。正常对照组大鼠胃黏膜色泽红润，未见损伤性改变。模型组大鼠胃黏膜充血明显，腺胃部可见散在斑点状糜烂、出血，UI为（16.83±4.96）；与模型组相比，三七总苷治疗组和雷尼替丁组胃黏膜充血减少， UI值均明显下降(P0.01)，提示水浸-束缚冷应激可致急性胃黏膜损伤，而三七总苷可以明显减轻应激对胃黏膜的损伤，说明其对应激状态下大鼠胃黏膜具有保护作用。见表1。本研究采用水浸-束缚应激模型，应激组大鼠胃黏膜可见明显充血、糜烂、和溃疡形成，说明动物模型制

17、作成功。预防性给予三七总苷和雷尼替丁后仅见胃黏膜轻度充血水肿，偶有黏膜表层脱落，出血、溃疡发生较轻。结果提示三七总苷及雷尼替丁均可明显预防大鼠应激性溃疡的发生。表1 应激大鼠胃黏膜损伤程度及抑制率比较（略）与模型组比较,P0.01;n=63.2 透射电镜观察应激大鼠壁细胞形态变化结果见图1ad。正常对照组大鼠胃壁细胞呈圆形，细胞表面微绒毛排列整齐密集，细胞内可见大量线粒体及散在分布的囊泡和管泡状结构，分泌小管少见，且分泌小管内绒毛稀少或者缺如，呈现明显的静息状态，见图1a。模型组的壁细胞内囊管泡结构明显减少或消失，分泌小管增多，有的分泌小管可见开口于细胞膜表面，分泌小管内绒毛增多增长，排列密集

18、，胞浆内的线粒体丰富，细胞呈现泌酸激活状态。见图1b。说明水浸束缚应激可激活大鼠胃壁细胞泌酸状态，引起胃酸分泌增加，胃酸的分泌状态与壁细胞超微结构的改变相一致，并与胃黏膜损伤程度有明显相关性。与模型组比较，三七总苷组大鼠的壁细胞内可见少量分泌小管扩张明显，小管内绒毛分布或稀少或密集，有的细胞内分泌小管明显塌陷，出现膜包绕的高致密影像，细胞内囊泡样结构增多；而雷尼替丁组的壁细胞内可见大量的囊泡样结构，分泌小管明显减少。实验结果表明，预防性应用三七总苷和雷尼替丁，可改善应激状态下壁细胞激活的超微结构改变，二者均能有效地抑制壁细胞的酸分泌，较好地发挥了预防应激性溃疡的作用见图1cd。图1 三七总苷对

19、应激大鼠胃黏膜壁细胞超微结构的影响（略）4 讨论对应激性溃疡的认识始于100年前。1842年Curling报告了1例大面积烧伤患者并发十二指肠溃疡，1932年Cushing报告了中枢神经系统创伤或手术可并发胃十二指肠溃疡。随着胃肠生理学、重症监护医学等相关学科的发展，使人们对SU的研究更加深入全面，对其发生机制有了进一步认识。自1969年Guilbert提出应激的概念以来，人们逐渐认识到许多应激因素在细胞和器官水平，干扰机体正常的新陈代谢而导致各种疾病。目前，实验和临床研究都致力于探讨不同应激因素对机体的影响及作用机制。胃酸是最常见的内源性损伤因子，已取得了明确的研究结果和结论4，5。壁细胞的

20、功能主要是泌酸，其超微结构改变与泌酸程度有关。陆国明等6的研究证明了水浸-束缚应激可引起大鼠胃壁细胞结构的改变，并与胃黏膜损伤程度有明显相关性。李兆申等7通过透射电镜观察发现水浸束缚应激大鼠，壁细胞呈现明显的分泌状态，从形态学上证实了水浸-束缚应激可刺激胃酸分泌。胃是人体对应激反应最敏感的器官。胃黏膜对缺血缺氧极其敏感，所以胃黏膜缺血缺氧是导致应激性溃疡的最基本条件8。本课题以大鼠水浸束缚模型为研究对象，观察应激后胃黏膜损伤情况以及胃壁细胞超微结构变化,并观察三七总苷对应激状态下胃黏膜损伤及对壁细胞超微结构的影响。实验结果证实水浸-束缚应激时，胃黏膜出现广泛的糜烂、出血、溃疡形成。通过UI及抑

21、制率比较，发现三七总苷可以明显减轻应激对胃黏膜的损伤，说明其对应激状态下大鼠胃黏膜具有保护作用。实验发现，大鼠经水浸-束缚应激后致急性胃黏膜损伤的同时，壁细胞呈现不同程度的激活状态，尤以模型组为明显，壁细胞内分泌小管绒毛密集，胞浆内囊泡基本消失，呈明显的泌酸激活状态，并且这些超微结构的变化与胃黏膜损伤的大体观察相一致。提示应激因素可以激活壁细胞泌酸功能，从而加重胃黏膜损伤，而三七总苷可促进胃黏膜壁细胞从激活状态向静息状态转化，说明三七总苷对应激大鼠胃黏膜具有保护作用，可能通过调控壁细胞的泌酸功能而发挥其抗应激性胃黏膜损伤作用。已有研究证实，三七总苷可通过抗自由基损伤和减轻脂质过氧化实现对肾缺血

22、再灌注损伤的保护作用9；三七皂苷能有效改善内皮功能，具有显著降低血小板表面活性、抑制血小板黏附和聚集、降低血黏度、改善微循环、抗血栓形成等作用10。通过本实验胃黏膜和壁细胞超微结构形态学方面的观察，说明预先给予三七总苷防治应激性溃疡的作用是明显有效的，我们下一步的实验研究，将从三七总苷对氧自由基的影响，进一步探讨其抗氧化损伤的作用机制，为临床使用三七总苷预防和治疗SU提供理论依据。【参考文献】1 Samini M, Moezi L ,Jabarizadeh N, et al .Evidences for involvement of nitric oxide in the gastroprotective effect of bromocriptine a