离子交换层析分离核苷酸的实验方法

1、CN11-2034/T实 验 技 术 与 管 理第28卷 第3期 2011年3月ExperimentalTechnologyandManagementVol.28 No.3 Mar.2011离子交换层析分离核苷酸的实验方法胡晓倩,钟长明,陈来同(北京大学生命科学学院,北京 100871)摘 要:对传统的离子交换层析分离单核苷酸实验方法进行改革和创新。以强碱型阴离子交换树脂、采用梯度洗脱和阶段洗脱对酵母RNA水解液进行分离,利用标准核苷酸的参数确定层析峰的核苷酸种类。不但可以使学生全面掌握离子交换层析技术,而且经过对标准核苷酸性质的研究及核苷酸的鉴定,还可将原有实验内容从一个简单的分离纯化实验提

2、升为研究性实验,从而有效调动了学生的学习兴趣和学习热情,明显提高了学生的综合实验能力。关键词:核苷酸;强碱型阴离子交换树脂;阶段洗脱;梯度洗脱中图分类号:Q5-33 文献标志码:B 文章编号:1002-4956(2011)03-0032-04Investigationoftheexperimentalmethodaboution-exchangechromatographyforisolatingnucleotidesHuXiaoqian,ZhongChangming,ChenLaitong(SchoolofLifeSciences,PekingUniversity,Beijing100871

3、,China)Abstract:Thisarticleintroducesthereform,innovationandpracticeonthetraditionalion-exchangechroma-tographymethodusedforsinglenucleotideisolationbyfullyusingoflaboratoryinstrumentsandequipment.Utilizingstrongbaseanionexchangeresinandelutingwithdifferentways,includinggradientelutionandstep-wiseel

4、ution,andaccordingtostandardparametersofnucleotide,thenucleotidesinthechromatographicpeakfromthehydrolyzateofyeastRNAcouldbeidentified.Bythedifferentexperimentalwaysaboution-exchangechromatographyseparationofsinglenucleotide,itnotonlyenablesstudentstocompletelylearnthetechniqueofion-exchangechromato

5、graphy,butalsoraisesasimpleexperimentofisolationandpurificationintoahigherlevelofresearchaboutcharacterizationofnucleotidesamples,thereforeeffectivelypromotesthestudents in-terestandenthusiasminlearningandmarkedlyincreasestheircomprehensiveexperimentalability.Keywords:nucleotide;stronglyalkalineanio

6、nexchangeresin;fractionalelution;gradientelution核苷酸是核糖核酸及脱氧核糖核酸的基本组成单位。核苷酸类物质包括腺苷酸(AMP)、鸟苷酸(GMP)、胞苷酸(CMP)、尿苷酸(UMP)等及其衍生物,它们在医药、食品、保健、农业、畜牧业及化妆品中得到了广泛的应用1-2。核苷酸的生产方法有很多3,离子交换层析法是普遍应用中的主要分离纯化方法4。离子交换层析法是分离生物大分子有效而常用的生物化学实验技术,一直作为本科生生物化学实验教学的重要内容。随着实验室仪器设备的改善,对实验内容进行改革和创新势在必行,重新设计实验步骤、丰收稿日期:2010-05-20作

7、者简介:胡晓倩(1964 ),女,浙江省永嘉市人,大学本科,工程师,主要从事生物化学实验教学和研究工作.E-mail:huxiaoqian富实验内容、增强实验的研究性是本文重点研究的内容。1 实验材料与试剂材料:酵母RNA;强碱型阴离子交换树脂(型号为201 8)(聚苯乙烯-二乙烯苯,三甲基季铵碱型),来自本院生物化学实验室。试剂:4种核苷酸标准品(Sigma公司);0.3mol/L氢氧化钾溶液;2mol/L过氯酸;2mol/L氢氧化钠溶液;0.5mol/L氢氧化钠溶液;1mol/L盐酸;1mol/L甲酸钠溶液;0.2mol/L甲酸;0.15mol/L甲酸;0.02mol/L甲酸;0.01mo

8、l/L甲酸-0.05mol/L甲酸钠溶液(pH4.44);0.1mol/L甲酸-0.1mol/L甲酸钠溶液(pH3.74);0.2mol/L甲酸-0.2mol/L甲酸钠溶液。化学试剂均为分析纯。胡晓倩,等:离子交换层析分离核苷酸的实验方法332 实验仪器电热恒温培养箱(上海森信实验仪器厂);台式低速离心机(上海菲怡尔分析仪器厂);玻璃层析柱(1.1cm 20cm);蛋白核酸检测仪及记录仪(瑞典安玛西亚公司);自动部分收集器BS-100A(上海市沪西机电厂);双光束分光光度计(英国UNICAM公司);磁力搅拌器(上海市沪西机电厂)。r/min离心10min;弃去沉淀,上清液用2mol/L氢氧化钠

9、溶液调至pH=8;取出100 L用于紫外分光光度计测定核苷酸含量,其余部分用于离子交换层析分离。3.4 树脂处理取强碱型阴离子交换树脂用水浸泡2h,用浮选法除去细小颗粒,并用减压法除去树脂中存留的气泡;然后依次用4倍树脂量的0.5mol/L氢氧化钠和1mol/L盐酸浸泡1h,除去树脂中碱溶性和酸溶性杂质,均用去离子水洗至中性;最后用1mol/L甲酸钠溶液将树脂转变为甲酸型。3.5 离子交换柱的准备取内径1.1cm、高20cm的玻璃管柱,连接蛋白核酸检测仪及记录仪、部分收集器;将处理好的强碱型阴离子树脂201 8装柱,最后柱床高约8cm,用1mol/L甲酸钠平衡直至流出液不含氯离子(用1%硝酸银

10、检查);然后用0.2mol/L甲酸平衡,直至记录仪基线平稳;最后用去离子水洗至流出液接近中性。3.6 离子交换层析加样及洗脱将酵母RNA水解液上柱,用去离子水洗去未吸附的杂质,直至记录笔回到基线,用甲酸-甲酸钠溶液分段洗脱或梯度洗脱。3.6.1 分段洗脱法依次:用250mL、0.02mol/L甲酸,350mL、0.15mol/L甲酸,200mL、0.01mol/L甲酸-0.05mol/L甲酸钠溶液(pH=4.44);250mL、0.1mol/L甲酸-0.1mol/L甲酸钠溶液(pH=3.74)分段洗脱,控制流速3mL/min。部分收集器收集流出液,每个洗脱峰溶液分别用氢氧化钠调至pH=7,然后

11、用分光光度计在230350nm范围内进行扫描,并与标准品扫描图谱对照,确定各洗脱峰核苷酸种类,然后测定260nm处的吸光值8。3.6.2 梯度洗脱法梯度仪的混合瓶装300mL、0.02mol/L甲酸,贮液瓶装300mL、0.2mol/L甲酸-0.2mol/L甲酸钠溶液,控制流速1.5mL/min,部分收集器收集流出液,每个洗脱峰溶液处理同分段洗脱法。3 实验方法3.1 离子交换层析法离子交换层析法是在固相(即离子交换剂)和液相之间发生的可逆性离子交换反应。核酸经酸、碱或酶水解可以产生各种核苷酸的混合物。核苷酸带有几种可解离基团,其中含氮环上的 NH2(除尿苷酸外)pKa2值差别较大,导致各个核

12、苷酸的pI值有显著差别,所以在进行离子交换层析时它们与离子交换树脂的吸附能力是不同的。本实验以强碱型阴离子交换树脂,运用梯度洗脱法和阶段洗脱法对酵母RNA水解液进行分离。首先降低RNA水解液的离子强度,调整pH值,使核苷酸带负电荷;上样后核苷酸都能与离子交换树脂结合,pI值大的核苷酸与离子交换树脂的结合力弱,所以用含竞争性离子的洗脱液进行洗脱时是按照核苷酸的pI值从大到小的顺序被洗脱下来,而嘌呤和嘧啶碱基与树脂的非极性亲和力不同,综合两方面因素,4种核苷酸被洗脱的顺序为CMP、AMP、UMP、GMP。由于2 -磷酸基和3 -磷酸基的位置不同对碱基电荷的影响,2 -核苷酸更容易被洗脱下来。在水溶

13、液中核苷酸有其独特的吸收光谱65,用双光束分光光度计对标准核苷酸进行扫描,利用扫描图谱计算出标准核苷酸的参数,然后将强碱型阴离子交换层析分离纯化后的核苷酸溶液进行扫描并与标准核苷酸扫描图谱及参数进行比较,确定各洗脱峰为何种核苷酸。3.2 核苷酸标准品扫描图谱核苷酸在240290nm的紫外波段有一个强烈的吸收峰,将4种标准核苷酸溶液(含33mg/LAMP、CMP、GMP或UMP)用双光束分光光度计在230350nm波长范围内进行扫描。由于核苷酸吸光值受pH值的影响,所以测定之前用氢氧化钠溶液调整核苷酸溶液至pH=7。3.3 样品处理取20mg酵母RNA溶于2mL0.3mol/L氢氧化钾溶液中,置

14、于电热恒温培养箱中37 水解20h;然后用2mol/L过氯酸溶液调至pH=2以下,400074 结果4.1 标准核苷酸数据结果4.1.1 标准核苷酸扫描结果对核苷酸标准品扫描得到的扫描图谱见图1。图中 为波长,A为吸光值。4.1.2 计算各核苷酸标准品的相关参数根据图1可以得到单核苷酸的最大吸收波长 max34实 验 技 术 与 管 理和计算出的标准单核苷酸的一些相关参数见表1。表1中 260为对260nm光的吸收系数。图1 pH=7时核苷酸标准品溶液的扫描图谱表1 核苷酸标准品的物理常数核苷酸(2 ,3 混合)AMPCMPGMPUMPmr347.2323.2363.2324.2-3/(L m

15、ol-1 cm-1) 260 10A250/A2600.8400.8831.1360.799A280/A2600.1880.9040.6830.372A290/A2600.0200.3150.3010.055max/(nm)25927025226215.37.711.59.94.2 离子交换树脂分离酵母RNA水解液的结果4.2.1 强碱型阴离子交换树脂201 8分离核苷酸分段洗脱层析图谱及分析测得的分段洗脱法的层析图谱见图2。对分段洗脱得到的各洗脱峰溶液进行扫描,根据扫描图谱得到各峰的波长,并计算出各洗脱峰的一些相关参数,结果见表2。对照核苷酸标准品的物理常数,确定图2中各洗脱峰对应的峰1为C

16、MP、峰2为AMP、峰3为UMP、峰4为GMP。对照标准核苷酸参数的理论值可以进一步确定峰1.1为2 -CMP、峰1.2为3 -CMP、峰2.1为2 -AMP、峰2.2为3 -AMP、峰4.1为2 -GMP、峰4.2为3 -GMP。图2 强碱型阴离子交换树脂201 8分离核苷酸分段洗脱层析图谱胡晓倩,等:离子交换层析分离核苷酸的实验方法表2 各洗脱峰物理常数不同波长比下的吸光值比峰序号A250/A260峰1.1峰1.2峰2.1峰2.2峰3峰4.1峰4.20.8960.8610.8160.8150.8201.1431.134280nm/260mm0.8680.9530.180.1820.3440

17、.6910.691290nm/260mm0.2790.3370.0220.0280.0510.3000.288270271259259261252252 max/nm35将图3中各洗脱峰溶液进行扫描,经计算得到相关的物理常数,对照核苷酸标准品的物理常数,确定图3中峰1为CMP、峰2为AMP、峰3为UMP、峰4和峰5为GMP。对照标准核苷酸参数的理论值可以进一步确定峰4为2 -GMP、峰5为3 -GMP。计算出总回收率为77.11%。应用梯度洗脱的效果不如阶段洗脱,可以考虑降低洗脱液酸度和离子强度的变化梯度来改善洗脱效果9,降低洗脱液流速10,使各峰间距离拉开,分离效果更好。5 结论本研究以强碱

18、型阴离子交换树脂采用阶段洗脱法和梯度洗脱法对酵母RNA水解液进行有效分离,均得到较好的实验结果。分离得到的核苷酸纯度较高,回收率可达到70%以上。研究结果表明,尽管离子交换层析在实际应用中梯度洗脱法优于阶段洗脱法,但在分离核苷酸时使用阶段洗脱法分辨率比较高,基本可以将2 -核苷酸和3 -核苷酸分离开。使用梯度洗脱法虽然几种核苷酸也都得到有效分离,但其分辨率不如阶段洗脱法高。可以通过降低洗脱液的酸度和离子强度的变化梯度来提高梯度洗脱的分辨率,使各峰间距离拉开,分离效果更好。采用阶段洗脱法和梯度洗脱法分离核苷酸作为生物化学实验教学的内容,不但可以使学生全面掌握离子交换层析技术,而且经过对标准核苷酸

19、性质的研究及核苷酸的鉴定,还可将原有的传统实验的内容从一个简单的分离纯化实验提升到研究性实验的层次,从而有效调动了学生的学习兴趣和学习热情,进一步增强了学生解决问题和分析问题的能力。参考文献(References)1应国清,石陆娥,唐振兴.核苷酸类物质的应用研究进展J.广州食品工业科技,2004,20(2):126-128.2吴艳波,李周权,李仰锐.外源核苷酸的研究与应用现状J.饲料研究,2005(5):20-23.3张志军,温明浩,王克文,等.核苷酸生产技术现状及展望J.现代化工,2004,24(11):19-23.4袁平海,张国文.生物化学品生产技术M.江西:江西科学技术出版社,2007.5张龙翔,张庭芳,李令媛.生化实验方法和技术M.2版.北京:高等教育出版社,1997.6黄晓兰,李科德,陈云华.15种核酸水解产物的高效液相色谱分离及其在酵母抽提物分析中的应用J.分析化学,2000,28(12):1504-1507.7王镜岩,朱圣庚,徐长法.生物化学:上册M.3版.北京:高等教育出版社,2002.8李建武,肖能庆,