叶绿素的光敏性质探究

1、叶绿素的光敏性质探究（与二氢卟吩 e4 对比） 研究背景光敏剂的光漂白（photobleaching是指在光的照射下，光敏剂所激发出来 的荧光强度随着时间推移逐步减弱乃至消失的现象， 这是光动力诊断临床应用中 考虑光剂量和检测需用时间的一个重要因素。长波红光在组织中具有较大的穿透深度， 从而能保证足够的治疗深度： 大的 吸光度能保证充分利用光能量和尽可能减少药物剂量； 光敏剂吸光度的大小是决 定药物剂量的理论依据。过多的光敏剂分布于癌组织中势必会影响光的穿透深 度，然而使用过少的光敏剂又不能产生应有的疗效。 因此， 光敏剂的使用剂量要 依据其吸光度的大小和肿瘤组织的大小来权衡。对于同一种光敏剂

2、， 它的漂白时间将随入射光的光能流率的增大而减小。 再 次，除了与光敏剂的类型有关外， 还与初始浓度和入射光源的波长有关。 初始浓 度越大，光漂白时间越长。实验意义 ：探究不同浓度的叶绿素在不同光源、不同时间的照射下，其吸光 度随时间的变化， 探测其光漂白特性， 为更好地在临床应用上要保持光敏剂的有 效杀伤浓度，且控制好光敏剂的激发时间，这样才能保证治疗的效果。初步设想 ：探究叶绿素在不同浓度，不同光源，不同光照时间对光的敏感性：（ 1）用紫外检测得到叶绿素的紫外可见吸收光谱，与二氢卟吩e4 的光谱图比较。（最好能同时测定荧光光谱）（ 2）在叶绿素的最大吸收波长处检测浓度为 0.05 mg/m

3、l ， 0.1 mg/ml ， 0.2 mg/ml ， 0.3 mg/ml ， 0.4mg/ml 的叶绿素的吸光度，并制作曲线图，验证其是 否符合朗伯 -比尔定律。（ 3）实验设置了不同的六组光源：白光、红外光、黄光、绿光、蓝光、紫外 光，分别对 0.4mg/ml 的叶绿素待测样品进行垂直照射 10min、20min、30min、 40min、50min、60min、80min、100min,取照射后的各样品进行紫外-可见吸收 光谱的检测，通过光谱的变化，探究光敏剂叶绿素明显的光漂白特性。(4)另外，关于温度的影响关系实验，在恒温水浴锅里设置叶绿素溶液(0.4mg/ml)的温度分别为 7

4、76;C, 17C, 27C, 37C, 47C, 57C，然后检测其 吸光度，探究温度对吸光度的影响。(5)量取 1ml 0.8mg/ml 的叶绿素溶液分别加入 1.0ml0. 05mol/L 的 HCl 溶液, 1.0ml0.01mol/L 的 HCI 溶液，1.0ml 水，1.0ml0.01mol/L 的 NaOH 溶液，1.0ml 0. 05mol/L 的 NaOH 溶液,用 pH 计测定其 pH 值,再测定其在最大吸收波长下 的吸光度,探究 pH 值对吸光度的影响。仪器药品：SHIMADZI生产的 UV 1700 spectrophotometer (UV 1700 岛津 分光光度计

5、 ) 、紫外灯、红光灯、黄光灯、绿光灯、蓝光灯、白光灯、罩灯的纸 箱、插座、移液枪、石英比色皿、蒸馏水、擦镜纸、烧杯、 4ml 一次性试管( 8 支)、标签纸、容量瓶、黑色塑料袋、计时器、叶绿素( 1 mg/ml, 0.4mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.05 mg/ml), 0.5 mol/LNaOH溶液，0.5mol/L HCl 溶液实验所需的药品预先配制好， 配好的药品盛装在棕色细颈玻璃瓶中 , 避光低 温保存在冰箱冷藏室。实验步骤 ：叶绿素的光敏性质实验1. 待测叶绿素溶液的配制( 1 ) 1.0mg/ml 叶绿素溶液称取 25mg 叶

6、绿素，用去离子水完全溶解，再定容至25ml；(2) 0.8mg/ml 叶绿素溶液移取8ml( 1)号溶液，用去离子水定容至10ml ；(3) 0.4mg/ml 叶绿素溶液移取 10ml (1)号溶液,用去离子水定容至 25ml；(4) 0.3mg/ml 叶绿素溶液：移取3ml (1)号溶液，用去离子水定容至10ml;( 5) 0.2mg/ml 叶绿素溶液移取 2ml (1)号溶液，用去离子水定容至 10ml；( 6) 0.1mg/ml 叶绿素溶液移取 1.0ml (1)号溶液，用去离子水定容至 10ml；( 7) 0.05mg/ml 叶绿素溶液移取 0.5ml (1)号溶液，用去离子水定容至

7、10ml；2. 光照实验( 1 )选取 0.4mg/ml ， 0.3 mg/ml ， 0.2 mg/ml ， 0.1 mg/ml ， 0.05 mg/ml 叶 绿素溶液，在测量溶液 0分钟光照时的紫外吸收光谱，先找出最高吸收峰值对应 的吸收波长，根据光敏剂的光源选择原理， 选取了符合波长的光源作为激发光源。 在激发光源一致的条件下，再进行不同光敏物质的分组照射及紫外吸收光谱检 测。在不同浓度的叶绿素溶液进行紫外检测(450700nm),得出扫描图谱。附注：样品在502nm(S带)和656nm(Q带)处有两个特征吸收峰，在656nm 处叶绿素有一个强吸收峰，在502nm处有一个弱吸收峰，目前的分

8、析工作仍在 Q 带进行检测。选择Q带波长是因为在Q带检测有较高的灵敏性，物质在 Q带的吸 收强度比S带强。因此选定656nm为叶绿素的检测波长。随着溶液浓度的增大， 叶绿素在可见光区的吸收也增大， 但是吸收带的形状 没有发生变化。 不管是在高浓度还是在低浓度下， 除了吸收强度有所变化外， 吸 收峰的相对大小和位置没有变化， 也没有出现新的吸收带。 说明在不同浓度溶液 中叶绿素均以单体形式存在。(2) 在相同最大吸收波长656nm下，对刚配制好的各浓度叶绿素溶液进行 紫外检测测定吸光度，分析叶绿素的吸光度对浓度的关系是否符合朗伯-比尔定律。浓度(mg/ml)0.050.10.20.30.4吸光度

9、0.183110.444090.923831.427491.931152.51A度光吸叶绿素吸光度与浓度的关系y = 4.9757X - 0.0630.10.20.30.40.5浓度 /(mg/mL)叶绿素浓度与吸光度的关系曲线满足： y=4.9757-0.063 （R2=0.9999）,可见叶绿 素在浓度值为0.050.4mg/mL范围内，其与吸光度呈现一定的线性关系，符合朗 伯-比尔定律。故在以下不同光照时间中，只选取了 0.4mg/mL浓度的叶绿素溶液 作为实验检测。（2.1）采用紫光的光源在暗室中对待测样品（叶绿素，0.4mg/ml）进行10min、20min、30min、40min、

10、50min、60min、80min、100min、时间的垂直照射，每 次照射后取适量溶液进行紫外-可见吸收光谱的检测，分析叶绿素的光漂白特性。叶绿素在波长为紫光的光源下的光照时间与吸光度的关系:光照时间（min）10203040506080100吸光度（656nm）1.890261.863891.848631.816531.832281.802981.737791.69226紫光Ia.85A度光吸1.801.75 -1.70光照时间对吸光度的影响020406080100时间/min（2.2）用红光作为光源,分别把叶绿素的0.4 mg/ml进行10min、20min、30min、 40min、5

11、0min、60min、80min、100min时间的垂直照射，取照射后的各样品进 行紫外-可见吸收光谱的检测，在同种物质、时间间隔一样（10mi n）的条件下进 行了对比实验。叶绿素在红光光源下的光照时间与吸光度的关系：光照时间（min）10203040506080100吸光度1.900271.863891.814701.816531.746581.736991.635741.569701.90红光光照时间对叶绿素的影响1.85 _1.80 _红光A度光吸75706020406080100时间/min4.54.0 -3.5 -3.0 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 -0.0

12、-红光光照时间对叶绿素的影响10min20min30min40min50min500550600650700-0.5 -4450波长/nm(2.3) 用黄光光源分别把叶绿素的 0.4 mg/ml进行10min、20min、30min、40min、 50min、60min、80min、100min时间的垂直照射，取照射后的各样品进行紫外 - 可见吸收光谱的检测，在同种物质、时间间隔一样(10min)的条件下进行了对 比实验。光照时间102030405060708090100（min）吸光度1.801.761.701.651.611.581.541.501.471.44656nm969477300

13、942987057114617665561.851.80 -1.75 -1.70 -黄光对叶绿素的光照图谱 黄光5 0 5 0 5£ £-5-541 .1 .1 .1 .1A度光吸20406080 100叶绿素在波长为黄光光源下的光照时间与吸光度的关系:时间/min（2.4）用绿光灯光分别把叶绿素的 0.4 mg/ml进行10min、20min、30min、40min、50min、60min、80min、100min时间的垂直照射，取照射后的各样品进行紫外 -可见吸收光谱的检测，在同种物质、时间间隔一样（10min）的条件下进行了对 比实验。叶绿素在波长为绿光灯光源下的光照

14、时间与吸光度的关系：光照时间（min）10203040506080100吸光度（656nm）1.852421.833981.818241.802981.788211.773931.746581.72351绿光光照时间对吸光度的影响A度光吸1.801.75 - 绿光20406080 1001.70时间/min3.02.52.01.51.00.50.0450500550600650700波长/nm0min10min20min30min40min50min60min80min100min（2.5）用蓝光灯分别把叶绿素的 0.4 mg/ml进行10min、20min、30min、40min、 50mi

15、n、60min、80min、100min时间的垂直照射，取照射后的各样品进行紫外 - 可见吸收光谱的检测，在同种物质、时间间隔一样（10min）的条件下进行了对 比实验。叶绿素在波长为蓝光灯光源下的光照时间与吸光度的关系:光照时间（min）10203040506080100吸光度（656nm）1.891581.875611.841311.794681.766241.740721.662961.603391.901.85A度光吸1.801.751.701.6560蓝光对叶绿素的影响020406080100时间/min蓝光(2.6) 用白光分别把叶绿素的 0.4 mg/ml 进行 10min、20

16、min、30min、40min、 50min、60min、80min、100min时间的垂直照射，取照射后的各样品进行紫外 - 可见吸收光谱的检测，在同种物质、时间间隔一样(10min)的条件下进行了对 比实验。光照时间10203040506080100(min)吸光度(656nm)1.854371.821661.806151.791381.764771.739261.692261.660521.85 _白光对叶绿素的影响白光1.80A度光吸7570叶绿素在波长为白光灯光源下的光照时间与吸光度的关系:3.02.52.01.5 -1.00.50.0450500550600650700波长/nm0

17、min10min20min30min40min50min60min80min100min0201 1 40601801100时间/min(3) 在最大吸收波长656nm下(严格控制光照时间)，2C、17C、27C、37C、 47C、57T的0.4mg/ml叶绿素溶液测定吸光度，探究温度对叶绿素光谱特性的 影响。温度2C17C27 r37 r47 r57 r吸光度(656nm)1.565801.565801.574581.584591.616461.60339在温度为2C和17 C时，叶绿素的最大吸收波长为654bn,波长发生了蓝移，而在 27、37、47、57C时，最大吸收波长都在656nm，没有发生改变。（4）在最大吸收波长下656nm （严格控制光照时间），在0.8mg/ml叶绿素溶液的中，分别加入 1.0ml 水，1.0ml0.01mol/L 的 HCI 溶液，1.0ml0.01mol/L 的 NaOH 溶液，1.0ml0.005mol/L 的 HCI 溶液，1.0ml0.005mol/L 的 NaOH 溶液，用 pH 计 测定其pH值，再测定紫外吸收值，观测pH值