细胞培养ppt课件

1、细胞培育根本技术细胞培育的根本概念 传代： 细胞在培育器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培育器皿中。 原代培育 取自体内新颖组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培育。 n细胞培育：运用单个细胞悬液n组织培育：运用组织块O.51立方毫米或薄片厚0.2 毫米n器官培育：运用器官原基或器官的一部分或整个器宫原代培育细胞的生命归宿n原代培育期n传代期n衰退期n有限细胞系，无限细胞系 n细胞系 cell linen细胞株 cell strain 培育细胞的特性n 培育细胞的生长方式n贴附生长：n 必需贴附于支持物外表才干生长。见于各种实体瘤细胞n悬浮生长：n 于悬浮形状下即可生长，不需求

2、贴附于支持物外表。见于各种造血系统肿瘤细胞 每代贴附生长细胞的生长过程n游离期n贴壁期n埋伏期n对数生长期n停顿期平台期n游离期：n 细胞接种后在培育液中呈悬浮 形状也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。n 10分钟一4小时n贴壁期：n 细胞附着于底物上，游离期 终了。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。n 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等n 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白生长基质，这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。n进口塑料培育瓶涂有生长基质化学合成的功能基团n埋伏期n 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株埋伏

3、期一n般为624小时。n对数生长期：n 细胞数随时间变化成倍增长，活力最正确，最适宜进展实验研讨。n停顿期平台期：n 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂n 机制：接触抑制、密度依赖性培育细胞生长的条件n1 细胞的营养需求n2 细胞的生存环境n 温度: 37 n O2n CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-n pH: 7.2-7.4n 浸透压n 3 无污染n 4 无毒 实验预备实验用品：实验用品：超净任务台，压力蒸汽消毒器，电热枯燥箱，滤超净任务台，压力蒸汽消毒器，电热枯燥箱，滤器，酸缸器，酸缸CO2培育箱培育箱倒置显微镜倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器酶标仪、微

4、孔板震荡器液氮罐液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培育瓶，吸管，电动吸引器，培育板，耗材：培育瓶，吸管，电动吸引器，培育板， 冻存管冻存管n压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广n电热枯燥箱：干热消毒160 ，2小时。主要用干玻璃n器皿消毒 n滤器：过滤除菌：大多数培育用液，如人工合成培育基、血清、 n酶液等均采用滤过法除菌 n超净任务台：为细胞操作提供无菌环境n紫外灯 ：紫外线消毒。 主要用于培育室空气、操作台、塑料n培育皿和培育板等外表消毒 n 超净台n n超净任务台的任务原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐经过任务

5、台面，使任务台内构成无菌环境。 滤 器 CO2培育箱nCO2培育箱设定的条件为37 ，5CO2 。n运用CO2培育箱培育细胞时应留意的问题：n 用螺旋口瓶培育细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。n 坚持培育箱内空气干净。定期消毒n90 ，14 h)。n箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以坚持箱内湿度，避兔培育液蒸发。自动双重纯水蒸馏器 纯水仪酶标仪 微孔板震荡器培 养 板 培育瓶n 常用玻璃器皿清洗n浸泡自来水、刷洗洗衣粉、酸泡24小时、n流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干清洁液的配制2 细胞培育用液的配制水：新颖配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaC

6、l 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 mln消化液：n 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相衔接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分别。n n 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超越一定限制会损伤细胞。n 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。n胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。n用含血清培育液终止其对细胞的消化作用 培育基n培育基培育液是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培育基和合成培育基。n天然培育基：n天然培育基有血

7、清、血浆、和组织提取液如鸡胚和牛胚浸液。n优点：营养成分丰富，培育效果好n缺陷：来源受限。n 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。n 易发生支原体污染 合成培育基n 合成培育基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培育基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。n 合成培育基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。n 优点：规范化消费，组分和含量相对固定。n 本钱低 n 缺陷： 短少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需求。 n 人工合成培育基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁衍，还需补充一定量的天然

8、培育基如血清。n n n血清中含有：n多种蛋白质白蛋白、球蛋白、铁蛋白等n多种金属离子n； 激素；n 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。n各种生长因子n转移蛋白n不明成分n普通说来含5小牛血清的培育基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长普通需加 10血清n对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚n血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培育基中培育的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反响。n在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研讨领域，迫切需求用无血清培育基培育细胞n无血清培育基的主

9、要研制战略：在根底培育基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。n无血清培育基由根底培育基和替代血清的补充成分组成。n1975年，Sato初次胜利地用无血清培育基培育了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培育基中胜利地生长和增殖。n无血清细胞培育基的运用保证了实验结果的准确性、可反复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。n向无清培育液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培育液，很能够不适宜另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。 n 无血清培育基尚处于研讨阶段，难以推行。n 目

10、前，绝大多数人工合成培育基运用时还需添加血清 n血清质量好坏是实验成败的关键。n常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。n优质血清的规范：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。n血清的灭活消除补体活性：56 ，30 分钟n血清的消毒：过滤除菌n抗菌素的运用：n 在培育液配制后，培育液内常加适量抗菌素，以抑制能够存在的细菌的生长。n 通常是青霉素和链霉素结合运用。培育基内青霉素、链霉素最终运用浓度为每毫升100单位。n 庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定完全培育基的组成n根底培育基 80一95n血清 5一20n碳酸氢钠 2.0 g/

11、Ln青、链霉素 各100卑位毫升培育基的配制 RPMI-1640培育粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。 调理pH值至7.2 加血清终浓度 10 细胞传代方法n 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。n 1悬浮生长细胞传代n 离心法传代：离心1000转/分去上清，沉淀物加新培育液后再混匀传代。n 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培育液去除l2一23，然后用吸管直接吹打构成细胞悬液再传代。n 2 半悬浮生长细胞传代Hela细胞n 此类细胞部分呈现贴壁生长景象，但贴壁不牢，可用直接吹n打法使纫胞从瓶壁零落下来，进展传代。n 3

12、贴壁生长细胞传代n 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。贴壁生长细胞传代方法：n1 吸光培育瓶中的培育液n2 参与1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准n静置2-10 min显微镜下动态监测。n3 吸去胰蛋白酶液，参与培育液。n4 用吸管汲取瓶内培育液，反复吹打瓶壁细胞，构成细胞悬液。n5 汲取1/101/40细胞悬液，接种于新的培育瓶内。n6 加适量新颖培育液于接种了细胞悬液的新培育瓶内。n7 将后者放入培育箱中培育。细胞计数n血细胞计数器：手工计数细胞nCoulter计数仪：人工计数培育细胞活力测定n细胞活力测定是肿瘤体外研讨中运用最广的技术手段之

13、一。 n任何培育瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形状上区别死、活细胞是困难的。n1 细胞克隆构成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体构成肉眼可见的克隆。克隆构成卒用来表示细胞的增殖才干 n 克隆构成率比克隆构成数接种细胞数n缺陷：操作繁琐n优点：准确、可靠2台盼蓝法n 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占n细胞中的百分比表示细胞恬力 n n已淘汰3 四唑盐MTT比色法n四唑盐MTT商品名为噻唑蓝，n 四吐盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐复原成不溶干水的蓝紫色产物formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜DMSO能溶解堆积在细胞

14、中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值n MTT法简单快速、准确，广泛运用于新药挑选、细胞毒牲试n验、肿瘤放射敏感性实验等。n操作步骤n 1单细胞悬液接种于96孔培育板；103-104细胞/孔，每孔培育基总量200微升96孔培育板每孔容积370微升，37、5nCO2培育箱中培育一段时间根据实验目的决议培育时间n 2参与2毫克毫升的MTT液50微升孔；继续培育3小时。n 3吸出孔内培育液后，参与DMSO液150微升孔，将培育板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。n 4酶标仪检测各孔OD值检测波长570纳米。记录结果，绘制n操作步骤n 1单细胞

15、悬液接种于96孔培育板；103-104细胞/孔，每孔培育基总量200微升96孔培育板每孔容积370微升，37、5nCO2培育箱中培育一段时间根据实验目的决议培育时间n 2参与2毫克毫升的MTT液50微升孔；继续培育3小时。n 3吸出孔内培育液后，参与DMSO液150微升孔，将培育板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。n 4酶标仪检测各孔OD值检测波长为570 nm。记录结果，绘制细胞生长曲线细胞冻存和复苏n细胞低温冷冻储存是细胞室的常规任务。细胞冻存与细胞传代保管相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。冻存和复苏的原那么：慢冻快融n当细胞冷到零度以下，可以产生以下变

16、化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内构成冰晶。n n 假设缓慢冷冻，可使细胞逐渐脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会呵斥细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶构成大冰晶，即冰晶的重结晶。慢冻程序n规范程序：n 当温度在-25 以上时， 12 /minn 当温度达-25 以下时， 510 /minn 当温度达-100时，可迅速放入液氮中n 细胞冻存器n简易程序：n 将冷冻管管口要朝上放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，经过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在40分钟内降至液氮外表，停30分钟后，直接投人液氮中。低温维护剂的运用n在细胞冻存时参与温维护剂，能大大提高冻存效果。n常用的低温维护剂是DMSO，它是一种浸透性维护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前显显露细胞外，在胞外构成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存方法n1预先配制冻存液： 含20