埃博霉素的生物合成

1、埃博霉素的生物合成 阎家麒1， 鲁习金2（1. 湖北荆工药业有限公司，湖北 京山431800； 2. 湖北荆工生物工程有限公司， 湖北 荆门 448124）摘要：埃博霉素是由粘细菌纤维堆囊菌产生的次级代谢产物。与紫杉醇相似，它们可以抑制微管解聚，使细胞有丝分裂终止在G2-M期。在p-糖蛋白表达型的多药耐药性肿瘤细胞系中维持很大的毒性，而且比紫杉醇有更好的水溶性。全合成埃博霉素虽然可以实现，但是与发酵方法相比尚无经济可行性。本文介绍了埃博霉素生物合成基因簇的克隆和异源表达，同时也对Red/ET重组技术的特点以及在埃博霉素生物合成中的应用进行了详细阐述。关键词： 埃博霉素（埃坡霉素，埃坡西龙）；生

2、物合成；埃博霉素基因簇；埃博霉素D内酰胺衍生物；Red/ET 重组技术埃博霉素（埃坡霉素，埃坡西龙，epothilones）是由黏细菌纤维素堆囊菌分泌的结构为16元内酯大环为中心体，噻唑环配基为侧链的一类细胞毒性化合物，是一种具有类似紫杉醇微管蛋白聚合和微管稳定作用的新抗肿瘤药物（图1）。Fig.1 epothilones作者简介：阎家麒(1939-), 男，教授，专业方向：基因工程制药，天然产物有机合成。Tel: 013469789911 E-mail: yanjq991 埃博霉素的发现埃博霉素A和B是在20世纪90年代由Höfle及其同事最先从南非Zambesi河岸的泥土中找到一

3、种黏细菌纤维素堆囊菌Sorangium cellulosum(Myxococcales) 菌株So ce90，从其培养物中分离提取了一种抗真菌活性的化合物并对其进行性质研究1,2。首先用光谱和X射线衍射晶体学方法测定了埃博霉素的结构排布, 该化合物是依据它的结构亚单位，epotide, thiazol 和ketone命名的（图2）。Fig.2 The naming of epothilones1995年前后，Bollag等人发现埃博霉素是一种具有类似紫杉醇的促微管蛋白聚合特性、结构新颖的抗肿瘤化合物。这一结果立即引起许多有机化学家、生物学家、药学家及临床医生的极大关注，在国际上迅速开展了对埃博

4、霉素的多角度研究。2 埃博霉素化学生物学埃博霉素外观为无色油状，可在乙酸乙酯中形成粉末状结晶。上述埃博霉素A、B、C、D、E 5种分子结构仅存微小差别。埃博霉素总共有7个手性中心和一个大环，包括含有噻唑的侧链与一个环氧化物。2.1 微管聚合与解聚微管（microtubule）存在于几乎所有的真核细胞中，是有丝分裂期纺锤体、纤毛及鞭毛基体的主要成分。微管为中空柱状结构，外径约24nm，壁厚约5nm，其长度因细胞种类和功能不同而异。微管由、微管蛋白（tubulin）形成的异二聚体（heterodimer）为基本结构单位组装而成，和微管蛋白均为球蛋白，直径约5nm，、微管蛋白头尾相接交替排列成原丝（

5、protofilament）。13根原丝沿微管纵轴环状排列而成筒状。、微管蛋白二聚体是有极性的，即微管蛋白总是位于一侧，微管蛋白位于另一侧。因此，由、微管蛋白二聚体为组装单位形成的多聚体也存在极性，即一端为微管蛋白（正极），另一端为微管蛋白（负极）。微管的这种极性在其组装和执行功能过程中发挥着重要作用。细胞提取物在37、无Ca2+存在、加入GTP的条件下，微管可自发形成，当温度降低，则微管解聚3。2.2 以微管或微管蛋白为靶点的药物及其结合位点埃博霉素、紫杉醇、长春碱（vinblastin）和秋水仙碱(colchicines)都是作用于微管蛋白的天然药物，但它们的结合位点和作用机制不同。与长春

6、碱结合位点相互作用的药物包括长春新碱、长春碱和长春地辛（vindesine），它们作用于纺锤体微管而抑制有丝分裂，可快速、可逆、温度非依赖性地结合于微管蛋白，每分子的微管二聚体有两个长春碱结合位点，分别具有高亲和性（KD=0.2¬0.5mol/L）和低亲和性（KD=10mol/L）。但在微管蛋白二聚体上确切的位点尚未被阐明。近年来研究表明，长春碱的结合位点可能位于围绕微管蛋白第339位和微管蛋白第390位残基的一级结构中。长春碱可能结合于已聚合的微管上，抑制微管组装，也可能结合于微管多聚体形成凝聚和不全结晶。与秋水仙碱结合位点相互作用的药物结合于可溶性微管蛋白形成秋水仙碱/微管蛋白复

7、合物，使二者的构象发出改变，然后削弱微管末端的连接键，妨碍下一个微管蛋白分子连接于微管，最后使微管增长停止。研究表明，秋水仙碱结合于微管蛋白，使围绕第39位精氨酸的部分解旋，这一过程使得有丝分裂中期纺锤体微管解聚。秋水仙碱结合于微管蛋白时，A、B、C三个环的分子构象与化学特征需要有严格的结构与空间特征。秋水仙碱分子上的三个甲氧基是保证其完全结合亲和性和抑制微管聚合所必需的。 与紫杉醇结合位点相互作用的药物包括埃博霉素及其衍生物等。这些是另一类抗有丝分裂抗肿瘤药物，具有促进微管的聚合与稳定性的作用。实验研究表明，埃博霉素具有与紫杉醇相类似的稳定微管活性，其作用机制主要是，埃博霉素在低温、无GTP

8、或微管偶联蛋白（MAPs）和在Ca2+存在的条件下与微管蛋白N端第31位氨基酸和第217231位氨基酸结合，促进微管蛋白聚合，装配成微管，抑制其解聚，从而导致微管束排列异常，形成星状体，使纺锤体失去正常功能，导致染色体分离受阻，细胞核不能分裂，使得细胞有丝分裂终止在G2-M期，从而引起细胞毒性导致细胞死亡4。有研究认为，埃博霉素A和B是3H紫杉醇连接的竞争抑制剂，与紫杉醇具有几乎相同的IC50值，埃博霉素在结合到微管上时，占有不同的但可能是重叠的结合位点。是紫杉醇结合到微管蛋白聚合物的竞争性抑制剂。与紫杉醇比较，埃博霉素水溶性好，注射、口服均可；结构简单，有利于化学合成及衍生化；在P-糖蛋白表

9、达型的多药耐药性（MDR）细胞中也维持很大的细胞毒性，约为紫杉醇的20005000倍5。3 埃博霉素的全合成与紫杉醇比较，埃博霉素的化学结构相对简单，所以化学合成埃博霉素及其衍生物成为近年来生物有机化学家们关注的热点。埃博霉素是一种结构复杂的天然产物，天然产物的有机合成可谓是20世纪后十年对有机化学巨大挑战。埃博霉素一问世，有数十条全合成路线相继报道。其中，卓有成效的是Nicolaou 、Danishefsky 和Schinzer等三个小组6-15。从1993年发现至今（2007年10月），有关埃博霉素研究报告的文献量约有500多篇。国外报道全合成埃博霉素的方法路线不下30余种。但是，具有商业

10、价值的全合成方法必须具备合成步骤短、最长线性片段少、总产率高这3个优势。在上述三个研究小组的全合成方法中，Danishefsky大环羟醛缩合方法、Nicolaou大环内酯化方法、Schinzer烯烃复分解方法、Nicolaou烯烃复分解方法和Danishefsky烯烃复分解方法16-17具有一定的可行性。如表1Tab. 1 Synthesis of Nicolaou, Schinzer and Danishefsky groups Synthesis Total Steps Longest Linear Overall yield Sequence(LLS) along LLSDanishef

11、sky Macroaldol 37 24 2.6%Nicolaou Macrolactonization 27 20 4.3%Schinzer RCM 33 17 1.1%Nicolaou RCM 15 9 6.6%Danishefsky RCM 25 22 0.8%全合成埃博霉素步骤冗长，产率颇低，现有文献提供的方法目前尚无工业化实用意义。4 埃博霉素生物合成4.1 诱变育种以纤维素堆囊菌培养方法进行埃博霉素的大规模生产是理想的途径。但是目前微生物发酵方法生产埃博霉素的产量都很低。1996年Hofle等人的经典报道2，以Sorangum cellulosum Soce90为生产菌株，埃博霉素

12、A和B产率分别为22和11mg/L。遗憾的是，该结果没有被后来的研究者们所证实。近10年中，在生物合成埃博霉素的研究上又有新的进展，如李越中等18对成团生长的纤维堆囊菌液体均衡生长的驯化，采用适合埃博霉素A产生的地瓜淀粉、水解乳蛋白等的选定以及综合地消除产物代谢积累的混合树脂添加方法等步骤，使得埃博霉素A的产量达到62.7mg/L的水平。但是该方法需要重复传代驯化，在100代时方可达到上述产率水平，每传1代至少12天，100代则需1200天（3年多），即使在此期间不发生菌种退化、变异等问题，这样冗长的生产周期显然不适合大规模生产。邱荣国19采用定向诱变筛选方法，获得了一种以埃博霉素D为主要代谢

13、产物的新菌株S. celulosum BGS4。获得的新菌株由于缺乏EpoK氧化酶功能，在其他条件相同的情况下，该类菌株只产生埃博霉素C和D，而不产生埃博霉素A和B。这一诱变菌株可通过一次或者多次的基因诱变及定向筛选（产物鉴定）而获得。美国施贵宝公司将So ce90菌株经过UV诱变继之以随机选择产生So ce90B2菌株，然后再用亚硝基胍（NTG）诱变，得到高产菌株（SC16408）20。传统的生物发酵仍然聚焦在采用诱变的方法获得高产菌株，优化发酵条件和纯化工艺。目前，通过纤维堆囊菌发酵合成埃博霉素的手段仍然存在很大的局限性。首先纤维堆囊菌的分离和纯化工作繁琐，生产周期较长。此外，从发酵液中分

14、离、提纯产物的方法有待进一步优化。目前，埃博霉素传统的工业菌株育种技术仍然具有实用价值。4.2 埃博霉素的异源表达在埃博霉素异源表达的研究方面，美国Kosan生物技术公司建立了埃博霉素来源菌株的基因文库，构建了含有埃博霉素合成酶基因的载体。他们将埃博霉素基因转入到和纤维堆囊菌同目的黄色粘球菌（Myxococcus xanthus）中，表达出了埃博霉素A和B21。埃博霉素C和D在原始菌纤维堆囊菌中不易获得。由于粘球菌和纤维堆囊菌同源性高，这种异源表达有效地避免了产物对宿主细胞的内毒素作用。并且粘细菌代时短（约为5h，纤维堆囊菌一般为16h），易于遗传操作，埃博霉素生物合成基因酶在该宿主中异源表达

15、具有一点优势。通过优化发酵条件以后，该工程菌M. xanthus K111-40-1发酵合成埃博霉素D的平均产量可以高达23mg/L22-23。这种方法得到的埃博霉素D已经进入临床试验。现在他们又将埃博霉素基因转入到了大肠杆菌（Escherichia coli）22中。虽然大肠杆菌表达需要外添加前体，而且最终产量很低，但是它为组合文库的发展提供了一个手段，异源表达可以克服纤维堆囊菌生长迟缓、发酵困难的缺点，为大规模生产埃博霉素提供了一种新的方法。4.3 Red/ET同源重组技术在埃博霉素生物合成中的应用Red/ET重组技术是本世纪基因工程的创新技术，极大地促进了分子生物学的发展。Red/ET重

16、组技术具有同源序列短（4060bp）、重组效率高的特点，在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作，无需使用限制性内切酶和连接酶。此外，这种新型重组技术可直接将目的基因克隆于载体上，目的基因既可来源于细菌人工染色体也可以是基因组DNA。该技术成为基因功能探索以及新菌株构建的有力手段。张友明等25采用Red/ET同源重组技术和异质宿主菌，使埃博霉素的全长基因簇完整地缝合在一起，并转化到新的宿主菌中，解决了埃博霉素大全长基因簇的克隆和原始生产菌发酵产率低、发酵周期长等问题。埃博霉素生物合成主要是由I型聚酮合酶（PKS）催化完成的26, 埃博霉素的复合酶系统中同时含有PKS和NRPS

17、(非核糖体肽合成酶)摸块，包括1个负载摸块，1个非核糖体肽合成酶摸块，8个聚酮合酶摸块和1个能把脱氧埃博霉素转变成环氧埃博霉素的P450环氧酶。整个基因簇中有7个转录方向一致的基因（EpoA, EpoB, EpoC, EpoD, EpoE, EpoF和EpoK)，9个模块和46个结构域。埃博霉素生物合酶全长约56kb，埃博霉素生物合酶依照转录顺序依次是：epoA(149-kD, 编码1个负载模块) epoB(158kD, 1个NRPS模块) epoC(193kD,1个PKS模块2) epoD(765kD，4个PKS模块3-6) epoE(405kD, 2个PKS模块7和8) epoF(257k

18、D,1个PKS模块9加1个硫酯酶) epoK(47kD,1个细胞色素P450)， 同时由于epoA/epoB, epoC/epoD中存在基因的重叠现象，推测epoA/epoB, epoC/epoD可能共转录。而在epoB/epoC(147bp), epoE/epoF(15bp)和epoF/epoK(115bp) 基因之间短小的间区序列中没有发现转录终止子，这表明所有这些基因可能是由一个异常大的操纵子（56kb）构成。根据同位素13C标记实验结果和合成酶全基因簇功能的推测，埃博霉素的生物合成包括5个阶段：聚酮链的引发：在酰基转移酶的作用下，活化载体蛋白，形成活化中心。链合成的起始和噻唑环的形成：

19、在epoA和epoP模板的共同作用下催化乙酰基和半胱氨酸，缩合形成埃博霉素合成的特殊起始物2-甲基噻唑五元杂环。链的延伸和转移：埃博霉素骨架每经过一个模块就有一个二碳单元结合到聚酮链上，并加以适当的修饰。在延伸阶段，埃博霉素骨架依次经过epoC（1个PKS模块）、epoD（4个PKS模块）、epoE（2个PKS模块）和epoF（1个PKS模块），共经过了8个模块，形成了埃博霉素的16元骨架。链合成的终止释放和环化：在进行到epoF的末端的时候，16元环的骨架从活化位点转移到epoF末端区域中硫酯酶的丝氨酸位点上，终止了链的合成。在环化酶的作用下，自身分子内环化，解离形成16元大环内酯类化合物。

20、产物的后修饰:埃博霉素基因序列中的P450(epoK)是由420个氨基酸组成，氨基酸序列与细胞色素P450氧化酶的同源性很高，它催化埃博霉素C12-C13之间的环氧化，使埃博霉素C和D环氧化成为埃博霉素A和B。突变该基因，可以使埃博霉素的合成停留在C和D上 (图3)。Fig 3 Epothilone biosynthesis. Modular organization of the epothilone polyketide synthas(PKS). Functional domains of each of the epothilone PKS modules are shown. Ste

21、pwise synthesis of epothilones begins at EpoA and ends with the cyclization by the TE domain in EpoF to yield either epothilones Cand D or the hypothetical molecule containing the OH group at C-13. Abreviations: KS, -ketoacyl ACP synthase; Ksy, -ketoacyl ACP synthasecontaining a tyrosine substititio

22、n of the active-site cysteine; AT, acyltransferase; DH, dehydratase; ER, enoylreductase; KR, ketoreductase; MT, mrthyltransferase; ACP, acyl carrier protein; TE, thioesterase; C, condensation; A, adenylation; PCP, peptidyl carrierprotein.采用Red/ET重组技术是基于同源重组的一种对大的DNA分子（BAC/PAV/PI和科斯质粒）和细菌染色体进行修饰的主要方法

23、。埃博霉素全长基因簇的构建包括如下步骤：（1）埃博霉素基因簇的分离及科斯质粒epo14和epo35的构建。从粘细菌纤维堆囊菌中提取染色体DNA,经Sau3AI消化，电泳回收40-50kb片段,BamHI酶切科斯质粒，用连接酶连接后电转化大肠杆菌DH10B,获得含有埃博霉素基因簇的科斯质粒文库，利用P32同位素标记的探针，筛选5个含有埃博霉素基因簇阳性克隆，其中两个较大的克隆即上游的epo14和下游的 epo35。（2）科斯质粒epo14和epo35的修饰。在科斯质粒中引入SpeI限制性位切位点，设计引物，扩增出带有氯霉素基因和P15A启动子的寡核苷酸片段，利用Red/ET同源重组技术，以扩增的

24、片段同源替换epo14骨架，就构成了修饰的含有埃博霉素的上游科斯质粒。以相似的方法构成了修饰的含有埃博霉素基因簇的下游科斯质粒p-15A-epo35.（3）带有全长埃博霉素基因簇的重组质粒p15A-epo-km-zeo-cm的构建。将科斯质粒epo14 和epo35用限制性内切酶SpeI进行切割，然后用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物电转大肠杆菌GB2005, 通过抗生素联合筛选，并用菌落PCR进行鉴定，获得含有全长的埃博霉素基因簇的重组质粒p15A-epo-km-zeo-cm, 而且还为全长的埃博霉素基因簇加入了p15A的强启动子，有利于高效表达。（4）重组表达质粒p15A-IR-neo

25、-epo-IR-Tpase-BSD-oriT的构建。利用Red/ET基因重组技术在转座酶Tpase后面加入Blasticidin抗性基因（BSD）及oriT形成Tpase-BSD-oriT组件，插入到缝合后的埃博霉素基因的3'端，同源替换p15A-epo-km-zeo-cm中的组件，同时在epoA基因的前面插入 Tn5强启动子并带入另一端转座位点（IR）。然后，PCR扩增neo抗性基因，利用Red/ET同源重组技术插入到epoA的前面，就获得了埃博霉素全长基因簇的重组表达质粒p15A-IR-neo-epo-IR-Tpase-BSD-oriT。（5）重组表达质粒p15A-IR-neo-e

26、po-IR-Tpase-BSD-oriT（图4），转入异质宿主菌黄色粘球菌（Myxococcus xanthus）1622。利用卡拉霉素抗性和菌落PCR筛选到阳型的转化子，同时利用转座子诱导的同源重组将外源基因整合到宿主菌的染色体上，获得能稳定的高效异质表达埃博霉素的新型工程菌株。采用黄色粘球菌为异质宿主菌，是因为黄色粘球菌的遗传背景最为清楚，能表达埃博霉素基因来生产埃博霉素，而且可以利用基因工程技术进行改造。其次，黄色粘球菌1622比纤维堆囊菌由更短的倍增时间（5h）,可以提高装置的容积产率。 Fig. 4 Plasmid used for expression of epothilone

27、gene cluster 表达产物的HPLC检测如图6所示，转入重组表达质粒的假单胞菌工程菌的HPLC图谱上具有同原始菌对应的峰1，峰2和峰3（埃博霉素产物），但野生的假单胞菌则没有产生对应的峰1-3，而且假单胞菌工程菌的峰1和峰3的峰值比原始菌株对应的峰要大。说明缝合在一起的全长埃博霉素基因簇在异质表达宿主菌假单胞菌中获得了高效的表达。Fig.5 HPLC analysis of expressed epothilone product5 埃博霉素衍生物的半合成对细胞毒性的大量研究结果证实，埃博霉素类似物中的抗肿瘤活性比较认为：埃博霉素B内酰胺衍生物埃博霉素D埃博霉素B埃博霉素F埃博霉素A紫

28、杉醇27。事实上，目前已经上市的和进入II、III期临床试验5种埃博霉素类似物中有3种属于埃博霉素衍生物，即Ixabepilone、ZK-EPO和BMS-310705。在抗肿瘤活性筛选中不断发现新的埃博霉素衍生物，如26-fluoroepothilone B28, 12,13-desoxyepothilone B29 , pyridine epothilones30和12-Aza-epothilones 31等, 其中有些已经进入了I期或II期临床试验。作者采用半合成方法制得埃博霉素的一个新的衍生物埃博霉素D内酰胺衍生物(Aza-Epothilone D)，即以微生物发酵得到的埃博霉素D作为起

29、始材料，与催化量的四（三苯基膦）合钯（O）合叠氮化钠作用，在45，反应1h，使埃博霉素D大环开环，趋于形成-烯丙基钯络合物，得到一种单一的非对映异构体，即氮酸，氮酸经三苯基膦处理，生产氨基酸化合物，最后用1-羟基苯并三氮唑（HOBt）-EDCI和固体碳酸氢钠促进氨基酸环化反应，得到埃博霉素D内酰胺衍生物32（图6）。埃博霉素D内酰胺衍生物合理规避了专利壁垒，创制具有自主知识产权的埃博霉素新类似物。在埃博霉素系列衍生物细胞毒性和抗肿瘤实验中，发现埃博霉素D内酰胺衍生物是埃博霉素家族中抗肿瘤活性较高的一个化合物，极有优势开发出一种高效的后选抗癌新药。Fig. 6 Pd(o)-catalyzed n

30、ucleophilic substitution reaction to the regio- and stereoselective semisynthesis of aza-epothilone D6 埃博霉素新药临床研究目前，美国正在进行新药I、II期临床试验并取得预期效果的埃博霉素系列物为埃博霉素B、埃博霉素D（KOS 862）、BMS-310705、KOS-1584、甲基硫代埃博霉素、ZK-EPO、ABJ879和Fludelone(图7)。 Fig. 7 Epothilones in the phase I, II trialsIxabepilone（商品名“伊沙匹隆”，Ixempr

31、a）由美国施贵宝公司开发，于2007年10月16日获得FDA批准在美国上市，该药用于乳腺癌的治疗33，本品为注射剂。这是迄今第一个上市的埃博霉素衍生物（图8）。Fig. 8 FDA approved Ixempra(Ixabepilone), a semi-synthesis analog of epothilone BIxabepilone这种半合成的埃博霉素内酰胺衍生物在II期临床试验中显示了良好的抗肿瘤作用，尤其是对晚期同时接受阿霉素、紫杉醇、卡倍他滨治疗的乳腺癌病人，Ixabepilone单独用药，客观反应率能够达到18%。Ixabepilone联合用药对于三阴（雌激素受体阴性、孕激素

32、受体阴性和HER-2受体阴性）病人疗效显著。这种“三阴型”乳腺癌是一种独特的亚型，由于缺少相应有效的治疗选择，这类乳腺癌病例尤其难治，预后很差。Ixabepilone和卡倍他滨联合用药，治疗以前接受过阿霉素和紫杉醇治疗的晚期“三阴”乳腺癌病人，部分反应率达到23%。总共有126名病例，接受了Ixabepilone每三周40mg/m2, 静注给药，最多18个周期的治疗，独立放射评价委员会（IRRC）和研究人员统计的客观反应率分别为11.5%和18.3%。在所有的治疗组别中，反应出现的中位时间为6.1周，反应持续的中位时间为5.3个月。病情无进展生存时间和总生存时间的中位数分别为3.1个月和8.6

33、个月；6个月生存率为68.2%。紫杉醇的临床应用，致使肿瘤细胞产生P-糖蛋白表达型的多药耐药性（MDR），使得紫杉醇治疗无效。Ixabepilone对该种细胞维持很大的细胞毒性，凡用紫杉醇治疗无效的癌症，Ixabepilone都表现出显著的疗效。现在，Ixabepilone在美国正在进行前列腺癌、胰腺癌和肾癌为适应症的II期临床试验。Ixabepilone的治疗费用为每人每年1.84万美元至2.3万美元。预计到2012年，Ixabepilone的全球销售额将达到5亿美元。2008年2月4日，我国食品药品监督管理局已经受理了施贵宝公司的伊沙匹隆注射剂临床试验申请，预计该药将大量进入我国市场。Ix

34、abepilone注射剂目前的售价为：15mg/支，1380美元；45mg/支，3518美元，可谓名副其实的天价药品！20世纪后十年紫杉醇的面世，曾为人类攻克癌症带来一线希望。紫杉醇在临床和商业上所取得的巨大成功至今尚未减退。然而紫杉醇受来源所限，其本身的毒副作用以及多药耐药性细胞系等诸多因素，仍然有许多不尽人意之处。由此极大地激发了全世界科学家们寻求有类似作用的、更有效的、能够抗多药耐药性细胞系的抗肿瘤药物的积极性，一些实力雄厚的投资商、制药商也努力寻求与科学家的合作，在战胜肿瘤的征途上艰辛跋涉，埃博霉素有望成为21世纪取代紫杉醇的更为有效的抗肿瘤药物。但是，人类征服癌症之路依然漫长，然而埃

35、博霉素的发现、研究、开发和应用，无疑是继紫杉醇之后又一个彪炳人类抗癌史册的创举。 参考文献1 Hofle G H., Bedorf H., Steinmetz H., Schomdurg D. et al. Epothilone A and BNovel 16-Membered Macrolides with Cytotoxic Activity:Isolation, Crystal Structure, and Conformation in SolutionJ, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35:15672 girth K., Bedorf N.,

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