探究压力超负荷引起的心室重构和心力衰竭

1、探究压力超负荷引起的心室重构和心力衰竭    1 引言心肌肥厚是许多心脏疾病的代偿反应，其最终都会发生心力衰竭，而压力负荷增加是引起心肌肥厚进而发生心力衰竭的主要因素，尤其是高血压，压力负荷增加导致的心室重构是心力衰竭及其它心脏症状的最直接原因。虽然对影响心室重构和心力衰竭的研究有了一些进展，但目前确切的机制还没有完全阐明。热休克转录因子1（heat shock transcription factor1，HSF1）是热休克蛋白（heat shock protein，HSP）转录的调控者之一，对于它在心脏中的作用，国内报道较少，国外有研究表明它在心脏缺血

2、损伤的保护中发挥了重要作用，但其在压力超负荷引起的心室重构和心力衰竭中是否也有保护作用，还不是很明确，本实验旨在探究HSF1 对心室重构及心力衰竭的影响和其可能的机制，为临床治疗高血压性心肌肥厚和心力衰竭提供新的思路。2 材料与方法2.1 主要材料和试剂SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR：Invitrogen Company；Phospho-Akt antibody：Cell Signaling technology Company；RIPA 裂解液：碧云天生物技术研究所；vWF antibody：Chemicon Co

3、mpany；聚丙烯酰胺凝胶电泳垂直电泳槽：BioRedCompany；半干转移电泳槽：BioRed Company；Vevo770 小动物超声仪：VisualSonics company。2.2 方法(1).实验动物及其基因型鉴定健康雄性C57/BL6 小鼠：野生型小鼠、HSF1 基因敲除小鼠和HSF1 转基因小鼠，体重23-27g，周龄12-16 周(日本山口大学中井彰教授惠赠，复旦大学医学院实验动物中心饲养)。从小鼠尾组织中提取基因组DNA，鉴定HSF1 转基因小鼠的特异性引物： 上游TCCAGCACCCATGCTTCCTG ， 下游GAGACAGGAGCTCTTGGATA，扩增产物为76

4、1bp，反应条件：94变性5min，9430s、62 30s、72 90s 扩增35 个循环，最后72延伸10min；鉴定HSF1 基因敲除小鼠的特异性引物：上游CAGTGAAACTATGATGGTGTCTGC，下游ACCGAGCTCGGATCCACTAGTAAC 扩增产物204bp，反应条件：94变性3min，9430s、53 30s、7245s 扩增37 个循环，最后72延伸5min。PCR 扩增产物经1.2琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）电泳80V 60min，凝胶成像系统上进行扫描。(2).动物模型的建立及分组小鼠经乙醚麻醉，仰卧于手术台，气管插管成功后，切断左侧第3 肋骨，用26G 针头和

5、升主动脉结扎后，拔出26G 针头，使升主动脉缩窄（transverseaorta constriction，TAC）70以上，关胸，腹腔注射青霉素3 天饲养。做TAC 手术的小鼠共分3 组，分别为HSF1 基因敲除小鼠组（Knockout 组，23 只）、野生小鼠组（Wild-type组，22 只）、HSF1 转基因小鼠组（Transgene 组，19 只），同时有假手术组（Sham 组，20只）。（3） 心脏超声4：分别于手术后第1、2、3 和4 周末，做心脏超声，观察心脏形态学和心脏功能。(4)右侧颈动脉血压的测定、心肌标本的采集及处理：小鼠乙醚麻醉后，从右侧颈动脉插入27G 针头连接压力

6、换能器后测量血压，然后取出心脏，滤纸吸干称重后沿左心室长轴分成2 份，一份经中性甲醛、脱水、石蜡包埋后，做5m 组织切片，另一份液氮冷冻保存。(5) 左室质量和左室质量/体质量（LVW/BW）的测量：将小鼠麻醉称量体重后，迅速取出心脏并分离左心室（包括室间隔），称量心脏质量和左心室质量，LVW/BW 等于左心室质量（mg）/体质量（g）。(6) HE、Masson 染色：HE 染色主要观察心腔大小和心室壁厚度；Masson 染色中胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色，胞质和肌纤维呈红色，胞核呈蓝褐色，主要用于观察心肌间质纤维化情况，以HAPIS1000 型医学图象分析系统测量心肌胶原容积分数，计算每个切

7、片上蓝色占整个切片面积的百分比，每组老鼠取3 张切片取其平均值。(7) 因子相关抗原免疫组化染色：心肌标本用4%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋后垂至于其长轴，每隔1mm 切片一张，厚度为5m。采用因子相关抗原二步法，先加因子多克隆抗体，再加通用型二抗，DAB 染色，荧光显微镜下观察，控制反应时间在5min-10min，冲洗，苏木素复染，中性树胶封片。内皮细胞染成棕黄色，每张切片随即选择5 个200 倍视野，计算每个视野内毛细血管的数目，取其平均值即为毛细血管密度。(8)逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）：取心肌组织提取RNA，紫外测总RNA 的纯度及含量。根据Genebank 提供的基因序列使用

8、primer design 软件进行引物设计。内参照GAPDH基因的上游引物：5'-GGAAAGCTGTGGCGTGATGG-3'，下游引物：5'-GTAGGCCATGAGGTCCACCA-3'，扩增产物为393bp; 缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）基因的上游引物： 5'-GTGATGGACAGGGTATGG-3' ， 下游引物： 5'-GGAGAAGAGCGGTTGTAT-3'，扩增产物为285bp。RT-PCR 按照说明书进行操作，反应条件为：94变性3min，94 30s

9、、55 30s、72 30s 扩增32 个循环，最后72延伸5min。PCR扩增产物经2琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）电泳80V 60min，凝胶成像系统上进行扫描，测目标基因和内参照基因的电泳条带灰度积分，以二者比值代表目标基因的相对表达量分析结果，以上试验重复3 次以上。(9) Western blotting：提取心肌的总蛋白，用BCA 法测定样品的蛋白浓度；聚丙烯酰胺凝胶电泳：加适量的6×上样缓冲液99变性5min，分离胶的浓度是12，每泳道加40g蛋白，样品先80V 电泳15 min，进入分离胶，然后100V 电泳1.5h 至胶下端1cm 左右，15V半干转移30min，将蛋白

10、印迹到PVDF 膜上，剪出目的条带；5牛血清白蛋白TBST 液浸泡封闭1h，加一抗(1:500) 4摇晃过夜，用TBST 液洗涤膜10 min×3 次；加二抗(1:5000)室温下摇晃1h；用TBST 液洗膜10 min×3 次；将膜放在0.5ml ECL 检测试剂混合液中孵育约1min，在暗室中X 光胶片曝光30s-3min，显影、定影。用Toptal 软件对胶片扫描进行条带的灰度分析，测量目标蛋白和内参照GAPDH 蛋白的电泳条带灰度积分，以二者比值代表目标蛋白的相对表达量，分析结果。3 统计学分析采用 SPSS14.0 软件包分析，实验数据以均数±标准差表示

11、，组间用单因素ANOVA 分析，两组间用独立或配对t 检验，P < 0.05 为差异有统计学意义。4 结果4.1 小鼠基因型鉴定结果PCR 结果显示，在Transgene 小鼠可以检测到转入基因（HSF1）的表达，而在Wild-type小鼠没有表达；同样，在Knockout 小鼠可以检测到置换基因片断（Replace fragment，Rf）的存在，该片断置换了敲除的基因片断，在Wild-type 小鼠没有表达。4.2 右侧颈动脉血压右侧颈动脉血压测定显示，同Sham 组比较，TAC 手术的Knockout、Wild-type 和Transgene 组血压均有明显升高，其差值有统计学意义

12、（P < 0.01），Knockout 和Wild-type组组间对比差值有统计学意义（P < 0.01），Transgene 和Wild-type 组组间对比统计学对比无差异。4.3 小鼠死亡率Knockout 组第1 周死亡4 只、第2 周死亡2 只、第4 周死亡1 只，总死亡率30.43%；Wild-type 组第4 周死亡2 只，总死亡率9.09%；Transgene 和Sham 组未见到死亡的小鼠，总死亡率为0%。4.4 左室质量/体质量（LVW/BW）TAC 小鼠LVW/BW逐渐增大，第2 周达高峰后逐渐变小，同Wild-type 组比较，Knockout组在每一个时期

13、都显著降低， Transgene 组都显著升高（组间对比p0.05）。4.5 心室壁厚度心脏超声显示，TAC 小鼠心室壁厚度逐渐变厚，第2 周达高峰后逐渐变薄，同Wild-type 组比较，Knockout 组在每一个时期都显著降低， Transgene 组都显著升高（组间对比p0.05），HE 染色也可观察到相同的结果。4.6 Masson 染色Masson 染色显示，同Wild-type 组比较，Knockout 组在纤维化都更明显，Transgene 组与之相反，组间对比其差值有统计学意义（p0.05）。4.7 心功能Knockout 组小鼠左室射血分数(left ventricular

14、 ejection fraction)第1 周就开始下降，Wild-type 组小鼠从第2 周开始下降，而Transgene 组未见到有下降，组间对比其差值有统计学意义（p0.05）；Knockout 组小鼠左室舒张末容积(end-diastolic volume of left ventricule) 和内径(end-diastolic inner diameter of left ventricule)数值第1 周开始增大，Wild-type 组第2 周开始增大，Transgene 组未见到增大，组间对比差值有统计学意义（p0.05）。4.8 RT-PCR同Wild-type 组比较，在第

15、4 周末，HIF-1mRNA 在Knockout 组表达下降，在Transgene表达升高，灰度值组间对比其差值有统计学意义（p0.05）。4.9 Western Blotting同Wild-type 组比较，在第4 周末，磷酸化Akt 的表达在Knockout 组表达下降，在Transgene 表达升高，其灰度值组间对比其差值有统计学意义（p0.05）。4.10 新生血管密度同 Wild-type 组比较，新生血管在Knockout 组下降，在Transgene 表达升高，其差值对比有统计学意义。5 讨论HSP 是生物进化过程中高度保守的蛋白家族之一，是应激时细胞合成的一组对细胞产生保护作用

16、的蛋白质。HSP 的转录合成受热休克转录因子HSF 的调控。HSF 包括HSF1、HSF2、HSF3 和HSF4，其中HSF1 被称为快速的应激反应因子，在非应激状态下，HSF1 呈无活性的单体形态存在于胞浆，在短暂高温、缺氧、微生物等物理、化学和生物性的应激刺激下，HSF1 由存在于胞浆中的无活性的单体向三聚体转化，并进入细胞核，使丝氨酸残基磷酸化，具备与HSP70 基因上游的热休克元件（heat shock element , HSE）结合的能力，调控HSP70 基因的表达，促使热休克蛋白70 基因转录和翻译。本文用缩窄升主动脉的方法，观察了HSF1 基因敲除小鼠和转HSF1 基因小鼠在压

17、力超负荷状态下心室重构以及心力衰竭的差异，同时从HIF-1 基因以及磷酸化Akt 的水平分析产生上述差异的可能。压力超负荷模型的方法有多种，如缩窄升主动脉、缩窄腹主动脉、药物以及循环容量增加等。从测定小鼠颈动脉压力可以看出，本实验中，升主动脉缩窄的小鼠血压同未做升主动脉缩窄的小鼠比，压力升高大约50mmHg，证明成功建立了压力超负荷模型，第4 周末HSF1 基因敲除的因组的小鼠血压偏低考虑是心力衰竭所致。这些结果为以后建立压力超负荷模型提供了借鉴的方法。HE 染色、Masson 染色和心脏超声结果显示，野生型C57/BL6小鼠升主动脉缩窄后，心肌开始出现代偿性肥厚，第2 周心室壁厚度达高峰，第

18、4 周心室壁厚度变薄并出现射血分数下降，出现力衰竭的症状。这些结果都显示了该方法建立的压力超负荷模型可以出现心肌肥厚以及心力衰竭。本研究的结果显示，压力超负荷模型建立成功后，心脏间质纤维化逐渐明显，参与了心室重构的过程，是心室重构以及心力衰竭的重要因素。结果还显示，同对照组比较，心脏纤维化在HSF1 基因敲除的小鼠明显加重，在HSF1 转基因的小鼠心脏纤维化明显减轻。心脏超声结果，如射血分数、左室舒张末容积等显示，同对照组比较，HSF1 基因敲除的小鼠心肌代偿肥厚能力下降，出现心力衰竭的症状，死亡率升高，HSF1 转基因的小鼠心肌肥厚代偿能力增强，死亡率下降，可以延缓心力衰竭的发生和发展。结合因子相关抗原免疫组化染色的结果，在HSF1 转基因的小鼠血管新生数目增多，在HSF1 基因敲除的小鼠血管新生数目减少，可以证明HSF1 可能是通过调控血管新生，增强心脏对压力超负荷的代偿能力，延缓心室重构和心力衰竭的发生和发展，降低死亡率。为了进一步明确HSF1 调控血管新生的具体机制，我们从HIF-1 基因以及磷酸化Akt 的变化，分析了一些可能的原因。HIF-1 是一种分布和作用十分广泛的真核细胞转录因子，1992年由Semenza 首次发现于低氧上调促红细胞生成素（erythropoietin，E