蛋白质药物的PEG化学修饰

1、蛋白质药物的PEG化学修饰蛋白质药物的PEG化学修饰胡 涛中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室蛋白质药物的PEG化学修饰1.迅速被体内酶降解2.肾小球过滤清除3.抗原抗体反应4.溶解度差导致沉淀蛋白质药物在使用中出现的问题TC实际浓度理想浓度蛋白质药物的PEG化学修饰体外聚乙二醇修饰（PEG化）(1)增大药物分子量，避免被肾小球过滤(2)阻碍蛋白酶的降解作用(3)屏蔽药物的免疫位点(4)增加药物在体液中的溶解度(5)与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物 +蛋白或多肽偶联物聚乙二醇CH3(-O-CH-CH)n-OH蛋白质药物的PEG化学修饰分离工程反应工程剂型工程生物医药生物

2、能源生物材料生物化学品其它产品生化工程（生物化学工程，Biochemical Engineering）蛋白质药物的PEG化学修饰目 录 PEG修饰的国内外研究进展 PEG修饰剂的研发 PEG修饰方法 PEG修饰工艺的优化 PEG修饰产物的质量控制蛋白质药物的PEG化学修饰一、PEG修饰的国内外研究进展蛋白质药物的PEG化学修饰国际上PEG修饰技术的研究进展n美国Rutgers大学Davis教授70年代的工作n甲氧基PEG的应用n美国Enzon公司n美国最早从事PEG修饰蛋白质药物的公司n美国Shearwaters公司n各种PEG修饰剂的生产商n美国罗氏、先灵宝雅、安进nPEG药物：PEG-IN

3、F，PEG-G-CSFn其它：辉瑞、默克、葛兰素史克、施贵宝。蛋白质药物的PEG化学修饰国内PEG修饰技术的研究进展n国家863重大机密项目：人工血液代用品的研制，1997-2000n中国科学院重点项目：血液代用品和血液净化，2001-2005n国家重大科技专项课题创新药物和中药现代化：长效基因工程蛋白质和多肽制剂关键技术，2002-2005n国家863重点项目课题：核酸和多肽的修饰和剂型化技术，2007-2010nPEG修饰血红蛋白：I 期临床n（中科院过程所、凯正公司）nPEG修饰G-CSF：III 期临床n（格兰百克）蛋白质药物的PEG化学修饰修饰粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）延长

4、半衰期修饰人肿瘤坏死因子消除副作用修饰白介素I受体拮抗剂（rhIL-1Ra） 延长半衰期修饰牛胰核糖核酸酶（RNase）提高抗肿瘤活性修饰超氧化物歧化酶（SOD）提高半衰期修饰天冬酰氨酶（Aspartase） 克服免疫原性提高半衰期修饰人干扰素（IFN）提高半衰期修饰血红蛋白（Hb）血液代用品修饰胰岛素提高半衰期我国在PEG修饰蛋白质方面的一些工作蛋白质药物的PEG化学修饰二、PEG修饰剂的研发蛋白质药物的PEG化学修饰Sc-PEG 专利分析以PEG-OH为原料的必然途径CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nOH + 光气 + NHS CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-O-N

5、+ NH2G-CSFOOOCH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-NHG-CSF O单链修饰：(SC-PEG)蛋白质药物的PEG化学修饰Roche公司的长效干扰素产品专利分析同样是以PEG-OH为原料的必然途径 双链修饰：蛋白质药物的PEG化学修饰新的修饰策略采用新方法制备新的修饰剂以PEG-COOH（CM-PEG)为原料的必然途径，已获专利CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2OHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-O-N + NH2G-CSFOOO单链修饰：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHG-CSFO(CM-PEG)蛋白质

6、药物的PEG化学修饰我们的策略以PEG-COOH为原料的必然途径CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOO双链修饰：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH + Lysine OCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-O-N+ NH2IFNCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-NHIFN蛋白质药物的PEG化学修饰1、PEG修饰剂的批量制备取得了成功取取 得得 的的 主主 要要 进进 展展mPEG-CH2CH2OH +TEMPO/KBrmPEG-CH2COOHNaC

7、lOice bath, H2Olys-OEt 2HClmPEG-CH2CONH-CH2CH2CH2CH2mPEG-CH2CONHCOOC2H5mPEG-CH2CONH-CH2CH2CH2CH2mPEG-CH2CONHCOOH0.1M NaOHmPEG-CH2CH2OH +TEMPO/KBrmPEG-CH2COOHNaClOice bath, H2OGlu(OEt)2HClTEADCC,NHSmPEG-CH2COO-NOOmPEG-CH2CONH-CHCH2CH2COOEtCOOEtmPEG-OH + Cl3C O COO Cl3+NHOOOO COOmPEGNOO+NNHClClOOmPEG-

8、OHOOOOO+mPEGmPEGbasedioxane,refluxacid50oCNHCOOHNaOHNHCOONaEOH+NCOOHCH2CH2OHml分枝型ZL 01141745.5l分叉(长尾)型ZL 03100736.8l可逆型ZL03105003.4l不可逆型200410029577.1ZL02120740.2l异端基双官能团200410029577.1蛋白质药物的PEG化学修饰聚乙二醇修饰剂产品产品号产品号末端基团末端基团分子量分子量包装（包装（g）价格价格（￥）（￥）mPEG-OH5-OH5K100103500700mPEG-OH10-OH10K1001070001400mPE

9、G-OH20-OH20K1001070001400mPEG-COOH5-COOH5K10010100002000mPEG-COOH10-COOH10K10010150003000mPEG-COOH20-COOH20K10010200004000MPEG-NHS5-N-羟基琥珀酰亚胺5K1001052000040002000MPEG-NHS10-N-羟基琥珀酰亚胺10K1001053000060003000MPEG-NHS20-N-羟基琥珀酰亚胺20K1001053500070003500蛋白质药物的PEG化学修饰三、药用蛋白的PEG修饰方法蛋白质药物的PEG化学修饰创新技术（反应器技术和产物移

10、走技术）振荡反应器流加反应器缓释反应器固相反应方式膜耦合反应方式双水相反应方式Q. Yun, R. Yang, T. Chen, J. Bi, G. Ma, Z Su. J. Biotechnology, 2005, 118: 67-74中国发明专利，申请号200510114930.0 中国发明专利，申请号0410029577 1.修饰反应器设计PEG-pellet 反应器蛋白质药物的PEG化学修饰吸附蛋白吸附蛋白加入加入PEGPEG修饰修饰洗脱洗脱2.固相吸附法制备PEG修饰蛋白蛋白质药物的PEG化学修饰010203040PEG-SAKSolid PEG-SAK3222111Liquid P

11、EG-SAKSAKAbsorbance at 280 nmTime (min)固相吸附法与液相吸附法的比较1 1峰：原蛋白；峰：原蛋白；2 2峰：单修饰蛋白；峰：单修饰蛋白； 3 3峰：多修饰蛋白峰：多修饰蛋白蛋白质药物的PEG化学修饰PEG-INF的制备过程G-CSFPEG-G-CSFCH3(-O-CH-CH)n-OH甲氧基PEG（mPEG-OH）活化的mPEG-O-醛3.PEG醛制备单修饰的药用蛋白蛋白质药物的PEG化学修饰粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)MW: 18.8kd (174 amino acids) pI: 6.1,1 thiol, 1 N-terminal, 4 lysin

12、es, Half life: 5 h,Weekly injection: 7 times蛋白质药物的PEG化学修饰 三批PEG30-rhG-CSF产品的制备取取 得得 的的 主主 要要 进进 展展序号序号产品批号产品批号试制日期试制日期试制量试制量12007080012007-8-52007-8-15共共3750 mg：6 mg/支，302支；3 mg/支，210支；1.5 mg/支，520支；6.6 mg/ml，80 ml22007090012007-9-82007-9-18共共1263 mg：3 mg/支，400支；3.15 mg/ml，20 ml32007100012007-10-920

13、07-10-21共共1422 mg：3 mg/支，400支；3.4 mg/ml，65 ml。PEG化重组人生长激素，批产量1-10g；PEG化降纤酶，批产量6000支支；环孢素A眼用微乳制剂，批产量5000支支PEG化G-CSF2L修饰反应器计算机程序控制批产量3g生产周期10天蛋白质药物的PEG化学修饰修饰和剂型化产品质量达到国际先进水平生产规模产品质量批次稳定性-10-5051015202505101520Adsorbance at 280nmElution Volume, ml180190200210220230240250260-40-20020406080 IntensityWave

14、length (nm)1 2 3123123(A)(B)(C)以分子量为30kDa的PEG修饰rhG-CSF为例：(A)三批产品的SDS-PAGE检测图谱(B)三批产品的高效凝胶过滤检测图谱(C)三批产品的园二色检测图谱蛋白质药物的PEG化学修饰4. 引入巯基的方法制备PEG修饰蛋白(2) PEGylationSNH+(1) ThiolationHS-(CH2)3-C-NH-HbNH+NOOPEG-S-(CH2)3-C-NH-HbNH+OPEG NO2-iminothiolaneNH2-Hb蛋白质药物的PEG化学修饰Sangart公司是一家私营的生物制药公司，主公司是一家私营的生物制药公司，主

15、要从事氧载体的研发和产业化要从事氧载体的研发和产业化Hemospan - MP4 Phase I Sweden Status: CompletePhase Ib/II Sweden Status: CompletePhase II Sweden Status: Complete Phase II USA Status: Enrollment Complete Phase III Europe Status: Enrollment Complete 蛋白质药物的PEG化学修饰010203040PEG-LyzLyzAbsorbance at 280 nmTime (min)该PEG修饰产物的凝胶过

16、滤分析蛋白质药物的PEG化学修饰四、PEG修饰工艺的优化蛋白质药物的PEG化学修饰PEG修饰反应参数的优化 建立反应动力学，包括位点反应动力学和蛋白分 子反应动力学，优化反应时间 优化反应的pH值 优化PEG与蛋白的摩尔比 优化反应体系蛋白质药物的PEG化学修饰pTimeppppp 蛋白分子的修饰反应动力学Weijun Li, Zhiguo Su. Quantitatively investigating monomethoxypolyethylene glycol modification of protein by capillary electrophoresis, J. Biochem

17、. Biophys. Methods. 2004，59: 65-74蛋白质药物的PEG化学修饰0481216020406080100PEGylation (%)Incubation time (h) Val-1 Lys-11 Lys-56PEG修饰的位点反应动力学蛋白质药物的PEG化学修饰010203040PEGylated SAKSAKAbsorbance at 280 nmTime (min)PEG醛修饰药用蛋白的优化反应蛋白质药物的PEG化学修饰单修饰产物的分离纯化010203040506002040608010012014001020304050Conductivity(ms/cm)U

18、V280(mAU)Volume(mL) P1 P2蛋白质药物的PEG化学修饰分离产物分析0510152005101520UV280 (mAU)Retention volume (mL) 6.514.3 29.0 66.420.1116 200 KDa44.3 P1 P2 P1凝胶过滤分析凝胶过滤分析蛋白质药物的PEG化学修饰 膜耦合修饰工艺制备PEG化药用蛋白蛋白质药物的PEG化学修饰五、PEG修饰产物的质量控制蛋白质药物的PEG化学修饰IEF和SDS-PAGE鉴定PEG修饰蛋白1234+-Iodine stainComassie blue stainSDS-PAGEIEF1: Marker,

19、 2: HbA, 3: -Hb 4: (Propyl-PEG5K)6-Hb5: (Propyl-PEG5K)6-Hb1: HbA, 2: -Hb 3: (Propyl-PEG5K)6-Hb4: (Propyl-PEG5K)6-Hb 1 2 3 4 4 5 5 94.0 66.2 43.0 31.0 20.1 14.4 蛋白质药物的PEG化学修饰20406080100120140 -T1 -T1Absorbance at 210 nmTime (min)RP-HPLC分析胰蛋白酶切片段蛋白质药物的PEG化学修饰质谱分析胰蛋白酶切片段2004006008001000020406080100120P

20、EG5K-y7y1y4y6y5y1y4V H L T P E E Ky6y7y5147.1502.2602.8716.4853.3Intensity (%)Mass (m/z)10002000300040005000600070000200400600800IntensityMALDI-TOF/TOF分析分析PEG修饰位点在修饰位点在Val-1( )蛋白质药物的PEG化学修饰200210220230240250260-15000-10000-500005000 SAK PEGylated SAKdeg. cm 2.mol-1Wavelength (nm)30032034036038040004

21、008001200 Fluorescence intensityWavelength (nm) SAK PEGylated SAKPEG修饰蛋白的结构鉴定圆二色光谱鉴定圆二色光谱鉴定荧光光谱鉴定荧光光谱鉴定蛋白质药物的PEG化学修饰1015202530050100150200Absorbance at 280 nmTime (min) PEG20K-SAK PEG30K-SAK PEG40K-SAKRP-HPLC分析PEG修饰蛋白蛋白质药物的PEG化学修饰 蛋白质修饰剂及其制备方法和用途,中国发明专利， ZL01141745.5 制备分枝型聚乙二醇的新方法,中国发明专利， ZL02120740

22、.2 带PEG长尾的蛋白质修饰剂的制法和用途,中国发明专利， ZL031100736.8 聚乙二醇羧酸的制备方法和其用途 ,中国发明专利， ZL 200310113367.6 重组人复合干扰素-聚乙二醇偶联物的制备及其偶联产物,中国发明专利， ZL 200410029577.1 一种蛋白质交联剂及其交联方法,中国发明专利， ZL 03105003.4 一种分级分离制备血红蛋白偶联物的方法,中国发明专利， ZL 99106228.0 一种二醇聚合物动物血红蛋白偶联物的制备方法,中国发明专利， ZL 99106229.9 一种二醇聚合物动物血清白蛋白偶联物的制备方法,中国发明专利 ZL 00123

23、696.2 分子量均一的聚合物血红蛋白的制备方法,中国发明专利 ZL 01136190.5. 血红蛋白-人血清白蛋白偶联物制备血液代用品及其制备方法,中国发明专利， ZL 03109622.0PEG修饰的SCI论文Q Yun, T Chen, G Zhang, J Bi, G Ma , Z Su. A novel polyethylene glycol derivative suitable for the preparation of mono-PEGylated protein. Biotech Lett, 27, 213-217, 2005 Q Yun, R Yang, T Chen,

24、J Bi, G Ma, Z Su. Reproducible preparation and effective separation of PEGylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factor with novel “PEG-pellet” PEGylation mode and ion-exchange chromatography. J Biotech. 2005, 118:67-74 Q Yun, M He, W Xing, J Bi, G Ma, Z Su, A novel tetrafunctional reagent for simultaneous intramolecular and intermolecular cross-linking of bovine hemoglobin, Biotech Lett 26: 1359-1363, 2004. X Li, F Meng, G Ma , Z Su, A simple and efficient method for synthesis of carboxymeth