病理组织学诊断检材的制备技术

1、病理组织学诊断检材的制备技术一、组织的固定 凡需要进行病理组织学检查的标本（器官或组织），于离体（活体或尸体）后，应尽快置放（浸 泡）于装有足够量固定液的容器中固定。固定液量应为被固定标本体积的 510倍。置放标本的 容器大小视标本和固定液的体积而定，应适当大一些。临床科室切取的标本置放于容器中固定后， 应尽快送交病理科继续固定。未能及时、充分固定的干涸或腐败标本不能再进行固定和用于制做 切片。 常规固定液为 4%中性甲醛（10%中性福尔马林），应预先多量配制贮存，以备随时使用。小 标本的固定时间为 46 小时，大标本为 1824小时或更久。 根据病理学特殊检查（特殊染色和组织化学染色、免疫组

2、织化学染色和原位核酸分子杂交染色、 16电镜观察等）的需要，应选用其他适宜的固定液进行固定参见后述的“固定液的常用种类和 制备”。 器官、组织固定的基本方法 另参见本章第四节（病理标本的肉眼检查和组织学切片取材技术） 1食管、胃、肠、胆囊、膀胱等空腔器官：依规范方法剪开后，按其自然状态平铺于硬纸板上 （重点暴露黏膜面或内表面的病变处），并用大头针将标本边缘处固定于纸板上，然后放入 4% 中性甲醛中固定（黏膜面或内表面朝向容器的液面，并覆盖薄层脱脂棉）。 2肝、脾：由器官背面，沿其长轴每间隔 1.52.0cm纵向平行剖开，切成数片。将每片肝或脾 轻轻地平放于装有 4%中性甲醛的容器中，容器底面衬

3、以脱脂棉。应避免标本弯曲和相互间的叠 压。 3肺叶：放入固定液中的肺叶漂浮于液面，需在肺表面覆盖薄层脱脂棉。必要时从支气管注入 适量 4%中性甲醛。 4肾：沿肾外缘中线朝肾门方向作一水平切面（深达于肾盏），再行固定。 5淋巴结：先用 4%中性甲醛固定 1小时后，再沿其长轴切成数片（厚 2 3mm），继续固定。 6骨组织：先锯成小片（若是长骨应作横向锯片） ，在 4%中性甲醛中固定 24 小时后，再进行 脱钙。 7微小组织或液体沉淀物：先用拭纸或滤纸妥为包裹（需用大头针扎牢），然后放入专用小盒 内进行中性 4%甲醛固定，以防检材遗失。 8凡进入固定程序的标本必须连带其正确无误的病理检验号（病理号

4、）。 多数固定液对人体有害，需要防护，必须在封闭的通风条件下进行操作。 组织块的切取和固定：由较大标本切取用于制作切片的组织块（取材）时，应与标本的断面 平行，组织块厚度一般为 0.3 cm(不应>0.5cm)，面积一般在 11.5×11.5以内。切取组织块 的形状，在充分包括肉眼病变的前提下尽量规则些（例如方形、矩形、三角形等）；由一个标本 切取的多块组织的形状有所不同，便于蜡块与其相应切片的核对。 固定组织块的固定液量， 一般应为组织块总体积的 510倍以上。室内常温（25左右）下的固定时间为 324小时； 低温（4）下的固定时间应延长。固定组织块的容器要大一些。组织块固定

5、期间需要间断 地轻摇或搅动固定液以利于固定液的渗入。 常用固定液 14%中性甲醛（10%中性福尔马林）固定液 甲醛（40%） 100 ml 无水磷酸氢二钠 6.5g 磷酸二氢钠 4.0g 蒸馏水 900ml 2乙醇甲醛（酒精福尔马林，AF）固定液 甲醛（40%） 100ml 95%乙醇 900ml 说明一般组织块经乙醇甲醛固定 12小时后，即可移入 95%乙醇内脱水。 3Carnoy 固定液 无水乙醇 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml 说明组织化学染色的常用固定液，组织经 Carnoy 液固定 12 小时后，即可移入无水乙醇 中脱水。 4Zenker 固定液 17升汞 5.0g 重铬

6、酸钾 2.5g 硫酸钠 1.0g 蒸馏水（加至） 100ml 说明配制本液时，先将升汞溶于蒸馏水中、加温至 4050溶解后，再加入重铬酸钾，最 后加入硫酸钠，贮存待用。使用前加入 5ml 冰醋酸，混合。组织块需固定 1224小时。切片染 色前，需进行脱汞沉淀处理。 5Bouin 固定液 饱和苦味酸水溶液（约 1.22%） 75ml 甲醛（40%） 25ml 冰醋酸 5ml 说明本液临用时配制。组织块置于 Bouin 液固定 1224小时即可（小块组织只需固定数小 时） 。经 Bouin 液固定的组织被苦味酸染成黄色，可用水洗涤 12小时后进入乙醇脱水（兼脱色）。 不必将组织中的黄色除净（残存于

7、组织中的苦味酸无碍染色） 6过碘酸赖氨酸多聚甲醛固定液（PLP） A液：赖氨酸 1.827g 蒸馏水 50ml 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液(pH7.4) 50ml B液：8%多聚甲醛水溶液 100ml 说明本液临用时配制：取 A 液 3 份、B 液 1 份，混合后，加入过碘酸钠，使液体终浓度为 2%。组织块在 4下固定3654小时。本液对细胞结构和抗原性保存较好。 7B5（醋酸钠升汞甲醛）固定液 无水醋酸钠 1.25g 升汞 6.0g 蒸馏水 90ml 说明将以上物质混合、溶解，使用前加入甲醛 10ml。本液多用于固定淋巴组织。染色前应 进行脱汞沉淀处理。如不加甲醛称为 B4固定液（蒸馏水

8、为 100 ml）。 8丙酮固定液 冷丙酮（4）固定液用于酶组织化学染色。细胞标本的免疫组化染色也常用冷丙酮固定 10 分 钟。 青青灵芝草2010-01-31 22:30二、常规石蜡包埋组织切片（常规切片）的制备 组织块依序进行：水洗，脱水，透明，浸蜡，包埋和切片。 组织切片制备及其HE 染色过程中使用的乙醇、丙酮、二甲苯、石蜡等为 易燃、有毒物，必须专人管理，2m以内不得有明火，局部环境应有良好的通风和消防设施。 常规切片的手工操作（步骤次序和各步骤的持续时间） 1水洗：用流水冲洗已经固定的组织块 30min。 2脱水（常温下） （1）乙醇甲醛（AF）液固定 60120min （2）80%

9、乙醇 60120min （3）95%乙醇 60120min （4）95%乙醇 60120min （5）无水乙醇 60120min （6）无水乙醇 60120min （7）无水乙醇 60min 18注意事项未经充分固定的组织不得进入脱水程序。用于脱水的试剂容积应为组织块总体 积的 510 倍以上。自低浓度乙醇向高浓度乙醇逐级移进脱水。脱水试剂应及时过滤、更 换（500ml乙醇可用于 500个组织块脱水；加入硫酸铜的无水乙醇变蓝时，提示需要更换） 。 较大组织块的脱水时间长于较小者，应将两者分开进行脱水。组织置于无水乙醇内的时间不宜 过长（以免硬化）。丙酮脱水性能强，会使组织块过缩、硬脆，不宜用以

10、替代无水乙醇。 3透明 （1）二甲苯 20min （2）二甲苯 20min （3）二甲苯 20min 注意事项二甲苯的容积应为组织块总体积的 510 倍以上。组织块在二甲苯中透明的 时间不宜过长（以防组织硬、脆），并依不同种类组织及其大小而异；组织呈现棕黄或暗红色透 明即可。二甲苯应及时过滤、更换。组织经二甲苯适度处理后不显透明时，常提示该组织的 固定或脱水不充分，应查找原因并妥善处理。 4浸蜡 （1）石蜡（4550） 60min （2）石蜡（5658） 60min （3）石蜡（5658） 60min 注意事项熔化石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡箱内或水浴中（70 ）进行，不得用明火加温。熔蜡的

11、容积应为组织块总体积的 510 倍以上。组织块经二 甲苯适度透明后方可转入浸蜡过程，应尽可能减少将透明后组织块表面的二甲苯带入熔蜡中。 浸蜡时间适宜，过短时浸蜡不充分（组织过软），过长时组织硬脆。熔蜡应及时过滤、更换。 5包埋 （1）先将熔化的石蜡倾入包埋模具中，再用加热的弯曲钝头镊子轻轻夹取已经过浸蜡的组织块， 使组织块的最大面或被特别指定处的组织面向下埋入熔蜡中；应将组织块平正地置放于包埋模具 底面的中央处；包埋于同一蜡块内的多块细小组织应彼此靠近并位于同一平面上；腔壁、皮肤和 黏膜组织必须垂直包埋（立埋）。 （2）将与组织块相关的病理号小条置入包埋模具内熔蜡的一侧。 （3）待包埋模具内的

12、熔蜡表面凝固后，即将模具移入冷水中加速凝固。 （4）从包埋模具中取出凝固的包埋蜡块（简称蜡快），用刀片去除组织块周围的过多石蜡（组 织块周围保留 12mm石蜡为宜）。将包埋蜡块修整成为规则的正方形或长方形。 （5）将病理号小条牢固地烙贴在蜡块一侧（编号应清晰可见）。 （6）把修整好的蜡块烙贴在支持器上，以备切片。 （7）使用包埋机的方法按有关厂商的说明书操作。 （8）注意事项 应将组织块严格分件包埋。包埋时一定要首先认真核对组织块的病理号（包括亚号） 、块 数和取材医师对包埋面的要求，准确地包入相应的病理号小条。发生包埋差错时，必须立即与取 材医师和病理科当班负责人取得联系，及时处置。 必须严

13、防各种异物污染，勿将无关组织（包括缝线、纸屑或其他异物（尤其是硬质异物）埋入 蜡块内。 包埋过程要操作迅速，以免组织块尚未埋妥前熔蜡凝固。 包埋用的熔蜡应纯净，熔点适宜。浸蜡用软蜡（熔点为 4550），浸蜡、和包埋用蜡 均用硬蜡（熔点为 5658）。 包埋用熔蜡使用前应将先静置沉淀、过滤。 熔蜡时不得使用明火，以防燃烧。包埋用熔蜡的温度应<65；包埋用的镊子不可加温过高， 19以免烫伤组织。 6切片 （1）切片刀或一次性切片刀片必须锋利。使用切片刀时，必须精心磨备（在低倍显微镜下确认 刀刃无缺口）；使用一次性切片刀片时，应及时更新。 （2）载玻片必须洁净、光亮。 （3）将切片刀或刀片安装

14、在持刀座上（以 15°为宜）。 （4）将蜡块固定于持支持器上，并调整蜡块和刀刃至适当位置（刀刃与蜡块表面呈 5°夹角）。 （5）细心移动刀座或蜡块支持器，使蜡块与刀刃接触，旋紧刀座和蜡块支持器。 （6）修块（粗切）：用右手匀速旋转切片机轮，修切蜡块表面至包埋其中的组织块完整地全部 切到。修块粗切片的厚度为 1520m。注意：对于医嘱再次深切片（特别是在原切片中发现 了有意义病变而进行的深切片），应尽量少修块，以尽量好地获得有关病变的连续性。 （7）调节切片厚度调节器（一般为 46m），进行切片，切出的蜡片应连续成带，完整无缺， 厚度适宜（35m）、均匀，无刀痕、颤痕、皱折、

15、开裂、缺损、松解等。 （8）以专用小镊子轻轻夹取完整、无刀痕、厚薄均匀的蜡片，放入伸展器的温水中（45左右） ， 使切片全面展开。注意：必须水温适宜、洁净（尤其是水面）；每切完一个蜡块后，必须认真清 理水面，不得遗留其它病例的组织碎片，以免污染。 （9）将蜡片附贴于涂有蛋白甘油或经 3氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxy silane，APES)处理过的载玻片上（HE 染色时酌情使用，可省略，必要时）。蜡片应置放在载玻 片右（或左）2/3 处的中央，留出载玻片左（或右）1/3 的位置用于贴附标签。蜡片与载玻片之 间无气泡。 （10）必须立即在置放了蜡片的载玻片一端（

16、待贴标签的一端） ，用优质记号笔或刻号笔准确、 清楚标记其相应的病理号（包括亚号）。注意：必须确保载玻片上的病理号与相关组织石蜡包埋 块的病理号完全一致，不得错写或漏写病理号。 （11）将置放了蜡片的载玻片呈 45角斜置片刻；待载玻片上的水分流下 后，将其置于烤箱中烘烤（6062，3060min），然后即可进行染色。 （12）注意事项 组织块固定、脱水、透明和浸蜡的质量直接影响切片制备。切片过程中遇到的困难首先应注意 从切片前的上述各环节中寻找原因。 切片机的质量是制备优质切片的重要前提。要使用质量好的切片机，规范地切片，精心维护切 片机。 经由内窥镜、穿刺等获取的细小组织，应间断性连续切片多

17、面（一般至少制备 6 张蜡片，必 要时制备更多张）。需作特殊染色、免疫组化染色等的病例，可预制蜡片备用。 切片人员应细心操作，防范被切片刀具割伤。 常规切片的自动组织处理机操作（步骤次序和各步骤的持续时间，总计需要 14小时） 1乙醇甲醛（AF）固定液 2×60min 295%乙醇 2×60min 395%乙醇 2×60min 4无水乙醇 60min 5无水乙醇 60min 6二甲苯 30min 7二甲苯 30min 8石蜡 30min 9石蜡 60min 10石蜡 90min 2011包埋 （1）手工常规包埋：参见上述的“手工操作”项。 （2）用组织包埋机时，按

18、有关厂商说明书的规定操作。 13切片：参见上述的“手工操作”项。 14注意事项 （1）必须按有关说明书的规定，使用和维护自动组织处理机、包埋机、磨刀机、封盖玻片机等 仪器等。 （2）要严防因停电、机械故障等造成的组织块损坏。一旦发生此类事故，必须及时向科主任报 告，尽快采取应急措施妥善处置。 （3）使用自动组织处理机时：合理设定的运行时间（充分利用夜间）。固定、脱水的环境 温度不得>30。乙醇、二甲苯和熔蜡的容积，要大于组织块总体积的 510倍以上，并应经 常过滤，保持清洁；应经常检查试剂的浓度，及时更新。对于多量组织块，可按其大小分批进 行处理；小块组织可适当缩短处理时间。 青青灵芝草

19、2010-01-31 22:30三、快速石蜡包埋组织切片的制备 煮沸固定切片法 1固定：切取大小适宜（厚度<2mm）的组织块，尽快置入装有 58ml 10%中性 4甲醛的试 管中煮沸 1min，然后已入冷水中。 2脱水 （1）将已经煮沸固定的组织块取出，用刀片将其厚度修切至<1.5mm，随 即置入盛有 58 ml丙酮的试管中，煮沸 2 min，然后将丙酮倾弃。 （2）再向该试管中重新加入 58 ml丙酮并煮沸 2min。如此重复34 次。 3浸蜡：将已经丙酮脱水的组织块由试管中取出，用吸水纸去除其表面液体，随即置入 7580 熔化的石蜡中，待组织块下沉、不再出现气泡时（约需 30s

20、），即可包埋。 4包埋、切片和染色。 （1）用热镊子将预制的蜡块表面熔化，埋入已经浸蜡的组织块。 （2）待埋入组织块的蜡块表面凝固后，即用载玻片轻压蜡块表面片刻，使 蜡块表面平整。 （3）将蜡块置入冰水中，使其变硬。 （4）迅速切片，裱片后用吸水纸去除载玻片上的水分。 （5）将载玻片用火焰烘干（勿距火焰太近）。 （6）迅速进行 HE 染色。 5注意事项 （1）为了尽量缩短制片时间，必须预先作好有关准备工作，备齐取材用具、试管、固定液、丙 酮、酒精灯、火柴（或其他引火器）、包埋用蜡块、载玻片和染色试剂等，放在固定部位待用。 （2）全部制片过程一般在 2025min内完成。 （3）制片后剩余组织块

21、应作常规石蜡包埋切片染色，进一步诊断。 （4）含脂肪较多的组织，须经多次丙酮处理。 （5）用于组织固定、脱水、透明的试剂和浸蜡用的石蜡应及时过滤、更换。 （6）丙酮、乙醇、二甲苯等为易燃物，进行上述各项流程时，2m 距离内不得存在明火。加温 脱水和浸蜡过程必须应用隔水温箱，不得使用干烤箱操作。青青灵芝草2010-01-31 22:31苏木素伊红（HE）染色 HE染色是应用最广泛的组织病理学常规染色技术。 染色程序 1石蜡切片HE染色（常规 HE 染色） （1）二甲苯 510min （2）二甲苯 510min （3）无水乙醇 13min （4）无水乙醇 13min （5）95%乙醇 13min

22、（6）95%乙醇 13min （7）80%乙醇 1min （8）蒸馏水 1min （9）苏木素液染色 510min （10）流水洗去苏木素液 1min （11）1%盐酸-乙醇 13s （12）稍水洗 12s （13）返蓝（用温水或 1%氨水等） 510s （14）流水冲洗 12min （15）蒸馏水洗 12min （16）0.5%伊红液染色 13min （17）蒸馏水稍洗 12s （18）80%乙醇 12s 23（19）95%乙醇 23min （20）95%乙醇 23min （21）无水乙醇 35min （22）无水乙醇 35min （23）石炭酸-二甲苯 35min （24）二甲苯 35mi

23、n （25）二甲苯 35min （26）二甲苯 35min （27）中性树胶封固 注：（12）和（13）项可省去，但（14）的冲水时间需延长至 1015min（细胞核显示更清 晰）。 （23）项可用无水乙醇代替；北方地区可省略。 2冰冻切片HE染色 （1）冰冻切片固定 1030s （2）稍水洗 12s （3）苏木素液染色（60） 3060s （4）流水洗去苏木素液 510s （5）1%盐酸-乙醇 13s （6）稍水洗 12min （7）返蓝（用温水或 1%氨水等） 510s （8）流水冲洗 1530s （9）0.5%伊红液染色 12min （10）蒸馏水稍洗 12min （11）80%乙醇 12min （12）95%乙醇 12min （13）无水乙醇 12min （14）无水乙醇 12min （15）石炭酸-二甲苯 23min （16）二甲苯 23min （17）二甲苯 23min （18）中性树胶封固 注：（7）和（8）项可省去，但（9）的冲水时间需延长至 1015min（细胞核显示更清晰）。 （15）项可用无水乙醇代替；北方地区可省略。 染色结果：细胞核呈蓝色，