植酸酶活力的测定方法及应注意问题

1、科技信息植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸的一类酶的总称 1。 植酸酶是一种胞外酶 2, 广泛存在于自然界中, 植物 、 动物 、 微生物均可 产生植酸酶 。 植酸酶的活性因来源不同而有差异 。植酸酶能将肌醇六磷酸 (植酸 分解成为肌醇和磷酸 。 植酸酶可以专 一性地水解植酸中的磷酯键, 使磷酸游离出来, 植酸酶将植酸分子上的磷酸基团逐个切下, 形成中间产物肌醇五磷酸 、 肌醇四磷酸 、 肌醇三磷 酸 、 肌醇二磷酸 、 肌醇一磷酸 、 终产物为肌醇和磷酸 3。 植酸酶的作用机 理见图 1。 图 1植酸酶的作用机理1. 植酸酶酶活力测定的意义 酶活力也称酶活性, 是指酶催化一定化学反应的

2、能力, 用在一定条 件下, 酶所催化某一反应的速率表示 。 酶活性是研究酶的特性, 分离纯 化以及酶制剂生产和应用时的一项不可缺少的指标 。酶活力单位是以酶活力为根据而定义的 。 国际生化协会酶委员会 规定, 1min 内将 1mol 的底物转化为产物的酶量定为 1个单位,称为 标准单位, 同时规定了酶作用的条件 。 因标准单位在实际应用时不够方 便, 故在生产上往往根据不同的酶, 制定各自不同的酶活力单位 。 在测 定酶活力时, 对反应温度 、 pH 、 底物浓度 、 作用时间都有统一规定, 以便 同类产品互相比较 。 但是酶活力单位并不能直接反映酶的绝对数量, 只 不过是一种相对比较的依据

3、 4。植酸酶活性的定义为:在最适宜条件下, 每分钟从一定浓度的植酸 钠溶液中释放 1mol 的无机磷所需要的酶量为一个酶活力单位 。 确定 植酸酶的酶活, 可以提高实验的标准性和效率 。2. 植酸酶活力测定的原理及方法酶活力测定的原理都是利用酶水解植酸钠形成无机磷,然后测定 无机磷的释放量 。植酸酶活性的测定方法较多 , 但至今尚没有被世界普遍公认的植酸 酶的定量分析方法 。 方法包括:钒 -钼酸铵法 、 硫酸亚铁 -钼蓝法 、 Vc-钼蓝法 、 丙酮 -磷钼酸铵法 、 微板法和微量比色法等 5。 可根据实验需要 选择不同的方法 。2.1钒 -钼酸铵法该方法是利用植酸酶可以水解植酸磷释放出无机

4、磷的原理 。 通过 加入酸性钼 -钒试剂使水解反应停止 , 同时与水解释放出来的无机磷 产生颜色反应 , 形成黄色的钒钼磷络合物 , 在 415nm 波长下测定磷的含 量 。 以标准植酸酶为参照物 , 间接计算被测样品中植酸酶的含量 。 本法于 1994年列入 AOAC, 我国也已将此法的测定结果作为审批商品植酸酶 注册许可证和验收进口产品的法定商检依据 。2.2硫酸亚铁 -钼蓝法该方法利用植酸酶可以水解植酸磷释放无机磷的原理 , 通过加入三 盐酸使水解反应停止 , 然后加入钼酸铵及 FeSO 4·7H 20的混合液使溶液 显色 , 在 720nm 波长下测定其吸收值 , 以标准酶为

5、参照物 , 间接计算被测 样品中植酸酶的含量 。2.3Vc-钼蓝法该方法是利用植酸酶可以水解植酸磷释放无机磷的原理 , 通过加入 三氯乙酸使反应停止 , 然后加入钼酸铵与 Vc 的混合液 , 使溶液显色 , 在 820nm 波长下测定吸光度 , 再以标准磷溶液的吸光度及磷溶液浓度对应 的酶活单位建立直线回归方程 , 最后以待测样品吸光度代入方程 , 计算 出酶活性 。2.4丙酮 -磷钼酸铵法磷酸盐与过量的钼酸铵在酸性条件下混合后 , 可慢慢生成黄色磷钼 酸铵 , 加入丙酮后将黄色物质提出来 , 在 355nm 波长处测吸光度 , 灵敏度 增加 10倍 。2.5方法比较不同的测定方法, 各有优缺

6、点 。 钒 -钼酸铵法灵敏度最高, 丙酮法稳定性最好, 抗干扰能力较强, 在测定饲料 、 发酵产物中植酸酶酶活, 采 用丙酮法较好 。AOAC 法测定出现酶活力结果偏小 , 原因可能是由于显色反应需要 在沸水浴中进行,溶液中已经存在的 TCA 可在高温下水解底物植酸钠, 因此造成误差 。 所以,用 TCA 做酶的灭活剂时, 不能采用 AOAC 无 机磷分析方法进行植酸酶的测定 。钼蓝 -Vc 显色法是在室温下进行的, 可减少 TCA 对植酸的水解作用, 分析结果相对准确 。 空白样测定时, 当采用 TCA 为灭活剂时,可能产生假酶活问题 。 如果改进程序, 先不加入 底物植酸钠, 而是将酶液与

7、缓冲液保温, 反应完成后用 TCA 将酶灭活, 然后加入底物,这样操作避免了 TCA 在热环境下对植酸钠的水解作 用, 能够较准确地测定植酸酶水解底物后释放的无机磷的量, 酶活力分 析结果更为准确 。3. 植酸酶活力测定中应注意的问题 3.1温度植酸酶作为一种酶制剂, 对温度非常敏感, 温度低会降低它的生物 活性; 温度高也会降低其生物活性, 甚至完全失活 。 因此, 在检测过程中 对温度的控制则显得非常重要,国标要求植酸酶活性测定时的温度为 (37±0.1 。 在 33 时植酸酶不能很好地发挥其活性, 酶活与其真实 值相比约低 10%; 在 40 时, 部分植酸酶会失活, 酶活与其

8、真实值相比约低 8%。 另外,水浴加热时, 水浴液面要超过试管内反应液液面, 使其 在规定时间内充分反应 。3.2pH 值pH 值在酶活测定时影响很大, 国标要求 pH 值为 5.5。 当 pH 值为 3.0时,植酸酶活力基本消失 。 尽量不要用酸度计来调节缓冲液的 pH 值, 因为酸度计存在一定的误差, 使用时间长了会发生钝化, 使测定的pH 值不准 。 可以通过计算缓冲溶液中 H +浓度的方法来配制一定 pH 值 的溶液 。3.3底物植酸钠的型号 植酸钠有两种型号, 一种是 Sigma p-3168, 分子量为 923.8; 另一种 是 Sigma p-8810, 分子量为 660.03。

9、 根据国标要求,植酸钠应为 Sigma p-3168, 在实验中发现 Sigma p-3168植酸钠底色浅, 且作磷标准曲线时 梯度较好检测植酸酶活性时用 Sigma p-3168为反应底物较好 。3.4离心速度和时间当水浴 30min 终止酶解反应后, 需要进行离心 。 国标要求 4000r/min,离心 10min 。 若以 3000r/min离心 10min ,则离心不彻底, 测吸光度时发 现标准曲线吸光度不呈梯度; 以 5000r/min离心 10min 时, 发现标准曲线各梯度的吸光度与以 4000r/min离心 10min 时相比偏低 。如果应用国 标改进法, 乙酸缓冲液中加入了牛

10、血清白蛋白, 离心时间需要 15min 用 国标改进法进行了时间对比实验,测定酶活时离心 10min 和 15min 后 样品的吸光度, 发现离心时间对测定结果影响很大 。4. 结束语在实际应用和理论研究中酶不易制成纯品, 其中含有很多杂质, 真 正的含酶量并不多, 所以酶制剂中酶的含量都用酶活力来表示 。 酶活力 大小是衡量酶制剂质量的主要指标,选择具有高度专一性和灵敏度的 酶活测定方法是酶制剂质量的保障 。 不同的测定方法有不同的应用范 围, 应根据实际情况进行选择, 并在测定中应注意其影响因素 。 参考文献1罗贵民 . 酶工程 . 第二版 . 北京 :化学工业出版社 ,2004:19-2

11、02JUSTIN ANNE-MAR R IE. Synthetic Capacity of Arabidopsis Phosphatidylinositol Synthase Lexpressed in Escherichia Coli. Molecular and Cell Biology of Lipids, 2003(12:52-603陈武根, 肖美燕 . 植酸酶的研究与应用 . 食品工程 ,2006,9(3:46-494张邦建 . 生物化学 . 高等教育出版社, 2007:41-425张娜, 郭庆启, 赵新淮 . 发酵液中植酸酶活力测定方法的改进 . 食 品工业科技 ,2006,27(12:173-174基金项目:本文系石家庄职业技术学院青年专项课题, 课题编号:09YQ005。 作