发酵法生产α熊果苷及其分离纯化

1、北京化工大学硕士学位论文发酵法生产-熊果苷及其分离纯化姓名：刘春巧申请学位级别：硕士专业：发酵工程指导教师：张鹏20100606北京化工大学硕：论文发酵法生产一熊果苷及其分离纯化摘要一熊果苷，一种高效、安全、配伍性强的天然美白活性物质。它比同分异构体一熊果苷的美白效果更好、更安全。本论文探讨利用嗜麦芽黄单胞菌一（）生物合成一熊果苷，并对产物分离纯化进行了研究。利用嗜麦芽黄单胞菌一催化合成【一熊果苷的方法具有原料简单，反应条件容易控制，反应周期短，产物纯度高等优点，具有重要的工业化意义。本论文系统地阐述了黄单胞菌的诱变筛选过程、发酵条件的优化及产物的分离纯化。通过对黄单胞菌的诱变筛选，最终获得了

2、一株酶活高、专一性强、遗传性状稳定的菌株；通过发酵条件的优化，确定了培养基的最佳配方为：蔗糖，蛋白胨，牛肉膏；培养的最佳条件：发酵培养基于三角瓶中，在。、摇床培养，加入反应物对苯二酚与蔗糖进行反应小时；发酵液以大孔吸附树脂进行分离纯化，通过对多种树脂的选择，最终选择了一种吸附力强、柱效高、寿命长的树脂一，分离纯化的最佳条件为：树脂吸附力为树脂，上柱液浓度为，上柱流速为，洗脱液浓度为酒精溶液，洗脱流速为，洗脱液体积为；洗脱液进行浓缩结晶，最终获得的产物纯度高达以上，整个工艺过程收率为以上。关键词：【一熊果苷，黄单胞菌，发酵，大孔吸附树脂，分离纯化北京化工大学硕十论文量仅一，；【一；，曲：，：，；

3、，北京化大学硕上论文，一，：，；，：【，砌，北京化工大学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：关于论文使用授权的说明学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布

4、学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在土年解密后适用本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。作者签名：导师签名：日期：巡臣二！二日期：圣芝！竺：！鱼：里北京化大学硕十论文第一章绪论熊果苷（）属氢醌苷化合物，化学名为一羟基苯基一一吡喃葡萄糖苷，是源于绿色植物的天然活性皮肤脱色组分，存在于熊果、越橘等植物中，是一种新兴的无刺激、无过敏、配伍性强的天然美白活性物质。熊果苷是国际上正在极力推广的高功效医药、化妆品添加剂，国际公认的高效祛斑美白剂，是美白化妆品理想的添加成份，国内外需求巨大，市场

5、前景广阔。熊果苷具有显著的抑制酪氨酸酶活性，减少酪氨酸酶在皮肤中的沉积，对皮肤有漂白、防色变和祛斑的功效。而且熊果苷与安甲环酸的衍生物及七叶醇等配伍具有极佳的美白作用，抗坏血酸一熊果苷磷酸酯等具有更理想的理化性质，这为开发更好的护肤品提供了思路。熊果苷有两种同分异构体，它们分别是一熊果苷（）和一熊果苷（），结构式如下：西呔迫。一例蠕熊果苷的概况熊果苷的美白机理为了比较了一熊果苷与其同分异构体一熊果苷的美白效果的差异，等观察了它们对来自磨菇及小鼠黑素瘤酪氨酸酶活性的影响。结果表明，一熊果苷抑制来自蘑菇及小鼠黑素瘤的酪氨酸酶，一熊果苷反抑制小鼠黑素瘤的酪氨酸酶，但一熊果苷强度为一熊果苷的倍。而且等

6、通过比较一熊果苷和一熊果苷在人体黑素瘤细胞的实验，发现一熊果苷美白效果是一熊果苷的倍以上。研究还发一熊果苷的美白机理是直接抑制酪氨酸酶活性，从而达到减少黑色素的生成；而不是通过抑制细胞生长或酪氨酸酶基因表达的方式来达到减少黑色素的生成的目的，在这个实验中还发现，浓度为的一熊果苷未见抑制细胞的生长，而熊北京化工人学硕：论文果苷在同样的浓度则出现有效地抑制，这进一步说明一熊果苷不是通过杀死黑素细胞来实现人体皮肤的美白效果的，而是通过影响酪氨酸酶来抑制黑素的生成来达到美白效果的。此外，在一熊果苷与人体黑素瘤细胞培养过程中未发现对苯二酚的存在。这不但说明了一熊果苷在使用过程中是稳定的，而且进一步说明一

7、熊果苷的美白作用是其本身的作用而不是其通过分解对苯二酚来实现。而一熊果苷在使用过程中会抑制黑素细胞的生长，长期使用会导致黑素细胞衰退，黑素细胞是人体防御紫外线伤害的一道屏障，所以如果长期使用一熊果苷会使人体降低人体自身对紫外线的防御。因此使用一熊果苷作为化妆品添加剂比一熊果苷更安全，且对人体没有任何副作用。国内外已经有多家大型化妆品公司使用一熊果苷代替一熊果苷作为美白剂添加剂晴。关于它们具体数据如表：表一熊果苷与一熊果苷的比较熊果苷稳定性的比较通过水溶性实验发现，一熊果苷的水溶性明显好于一熊果苷，在同等浓度下，一熊果苷只要轻微搅拌就很快溶解，而一熊果苷一般要搅拌很长时间依然有少量的不能溶解。而

8、且在相同浓度相同时间条件下，一熊果苷的水溶液比一熊果苷的水溶液更容易被氧化。所以一熊果苷的稳定性比一熊果苷高。熊果苷的制备方法熊果苷（）是从多种属植物中可分离得到的天然活性物质，其化学名为一羟苯基一吡喃葡萄糖苷（简称一熊果苷）。一熊果苷其去色素作用机制已有报道，是酪氨酸酶抑制剂，主要阻断多巴及多巴醌的合成，从而遏制黑色素的生长，因而具有皮肤增白作用。世纪年代由日本资生堂化妆品株式会社作北京化人学硕士论文为化妆品美白剂首先推出，它是继一半胱氨酸和曲酸等美白剂后又一个美白剂。不仅对皮肤的雀斑、老人斑、黄褐斑有消褪作用，而且对皮肤的滋润、皮肤灼伤后的愈合和粉刺等也颇有疗效。目前发达国家美白护肤市场几

9、乎已被熊果苷垄断。一熊果苷和一熊果苷的来源完全不同。一熊果苷可以通过植物提取、植物细胞培养和人工合成三种方法来制备。而一熊果苷一般只能通过不同的微生物的酶进行糖转移反应，让一分子的葡萄糖和一分子的氢醌结合形成单一的一熊果苷睁。日本学者等采用蔗糖磷酸化酶，在缓冲液中加入氢醌与蔗糖。反应可得一熊果苷。另有采用脂肪嗜热杆菌在硼酸缓冲液中制备。等利用枯草杆菌振荡培养，在有氧培养后纯化得培养液，在醋酸缓冲液（）加入氢醌、蔗糖和培养液反应制备一熊果苷。年等优化了一熊果苷催化的酶类型和反应条件，比较了环状糊精葡聚糖转移酶（）和葡萄糖苷合成酶（）对于氢醌的糖基转化率发现优于，在最佳反应条件中加入糊精有利于提高

10、苷的合成，同时防止生成物的分解，后达到最高产率。氢醌的苷化率达到（与氢醌的摩尔比）。特别是年等采用单胞杆菌属冻干细胞，在一缓冲液中使氢醌在反应，发生一端基异构体糖基化生成一熊果苷。虽然一分子氢醌中有两个酚羟基，但只有一个羟基被糖基化，同时没有其他副产物如麦芽三糖等的生成，氢醌的糖基化转化率达到（与氢醌的摩尔比），具体反应方程式如下：旧口伽工痒臻一豁上科一熊果苷的发展现状国内现状：国内目前所能生产的熊果苷基本上都是一熊果苷，而且主要是通过化学法合成；对于一熊果苷的生产尚未见报道，已有的文献主要是关于一熊果菅应用方面的研究；这主要是因为以下两方面原因：一方面是用普通的化学合成手段无法生产一熊果苷，

11、另外一方面是发酵法生产一熊果苷的难度较大，初期投入较多，风险较大，这导致从事这方面的研究机构很少。北京化火学硕：论文国外现状：年代中期美国哈佛大学和日本驰名化妆品公司在他们的医学研究中从熊果植物中发现了含有能够抑制黑色素的活性成份。为了将此发现造福于人类，研究人员历时载，潜心研究，终于从植物中提取出了一种无刺激、无过敏、配伍性强的天然美白活性物质一熊果苷。此产品一经问世，既受到化妆品科技领先的日本、美国的格外重视，并被广泛应用引。该产品已被收入美国化妆品组份汇编和中华人民共和国药典（年第版）年代初，日本资生掌等公司在世界上率先开发出含熊果苷的生物美白化妆品。美国一些医院用熊果苷临床治疗黑色素沉

12、着严重的病人，祛斑效果好，有效率达以上，而且没有毒害性、刺激性、致敏性。此后，世界上使用熊果苷美白剂的化妆品公司日益增多，特别是近几年来，有关添加熊果苷的护肤配方不断出现。国外临床试验证明，熊果苷对紫外线照射有安全性和稳定性，不但能卓有成效的抑制黑色素，而且还具有良好的配伍性，能协助其他护肤成份更好的完成美白、保湿、柔软、祛皱、消炎等作用。因此，发达国家的美白护肤品市场已被熊果苷所垄断。美国化妆品香精工业协会（）认为熊果苷是二十一世纪独领风骚非它莫属的皮肤脱色组份。绿色使者亦极力推荐“使用这种洋溢着绿色植物气息的化妆品。年末，日本江崎糖业公司与一家企业合作，成功开发出有皮肤增白效果的物质“阿尔

13、法一熊果苷（一熊果苷）”，其抑制黑色素的效果比现有的同类物质高大约十倍。该公司日前发表的新产品信息说，“阿尔法一熊果苷利用了由微生物的酶进行的糖转移反应，让一个葡萄糖与氢醌进行“阿尔法结合，其葡萄糖的结合方式与现有的一熊果苷不同。该公司使用人的正常细胞进行实验的结果表明，“阿尔法一熊果苷（一熊果苷）抑制黑色素生成的效果比现有的熊果苷（一熊果苷）高十倍删。熊果苷的应用化妆品国内外绝大多数学者均报道熊果苷具有美白活性，其美白机理为熊果苷对酪氨酸酶产生竞争性及可逆性抑制，从而阻断多巴及多巴醌的合成，进而抑制黑色素的生成，达到美白效果。但熊果苷不影响酪酪氨酸酶的表达和合成。熊果苷细胞毒性很低，其不形响

14、人黑色素瘤细胞生长的最高浓度为。在此北京化大学硕上论文浓度下，后黑色素合成受到抑制，且抑制作用呈剂量依赖性。因此熊果苷对皮肤能高效美白祛斑，逐渐淡化、祛除皮肤的崔斑、黄褐斑、黑色素沉着、粉刺和老年斑。一熊果苷作为最新的美容增白剂，世界知名品牌刚刚开始使用。年推出了含有一熊果苷的新活性皮肤增白剂，日本资生堂也推出了含有一熊果苷成分的系列化妆品附湖。经研究发现一熊果苷对紫外线灼伤所形成的瘢痕具有明显的效果，其化学性质也比熊果苷效果更为稳定，能够更方便的加入到各种美白亮肤化妆品中。之间最稳定，推荐添加量为，之间，可用到所有的配方中【引。目前熊果苷的效果比较理想但价格相对较高。其他用途（）烧烫伤药原料

15、：熊果叶具有抗炎、抑菌作用，统上用于治疗尿路感染，其中熊果苷是其主要药效。它是新型烧烫伤药主要成分，特点是快速止痛，消炎力强，迅速消除红肿，愈合快，不留疤痕。剂型：喷射或涂抹。（）肠道消炎用药原料：杀菌、消炎效果好，无毒副作用。（）镇咳、祛痰、平喘作用：熊果苷灌胃可增加动物气管分泌、延长氮水引咳潜伏期、咳嗽次数减少、气管酚红排泌显增多。剂量能延长哮喘潜伏期；剂能极显著地对抗豚鼠离体气管条的收缩【】。在抗炎、祛痰、镇咳三种作用中，熊果苷的镇咳效果尤其好切。但到目前为止，其抗炎、止咳、祛痰的机理尚未见报道。（）用药可增强人体免疫力：最新报导对艾滋病毒具有免疫功能。（）抗氧化作用：蓝钦艄刀采用体外培

16、养人脐静脉内皮细胞观察熊果苷对细胞的保护作用。结果表明熊果苷可以抵御所致细胞氧化应激损伤。大孔吸附树脂它是一种具有大孔结构的有机高分子共聚体，是一类人工合成的有机高聚物吸附剂。因其具多孔性结构而具筛选性，又通过表面吸附，表面电性或形成氢键而具吸附性。一般为球形颗粒状，粒度多为目大孔树脂有非极性（一，一，一，一），弱极性（一，一，一），极性（一，）之分。大孔吸附树脂理化性质稳定，一般不溶于酸碱及有机溶媒，在水和有机溶剂中可以吸收溶剂而膨胀。北京化工人学硕七论文根据类似物吸附类似物的原则，一般非极性树脂宜于从极性溶剂中吸附非极性有机物质，相反强极性树脂宜于从非极性溶剂中吸附极性溶质，而中等极性吸附

17、树脂，不但能从非水介质中吸附极性物质，也能从极性溶液中吸附非极性物质。大孔吸附树脂作用原理（）树脂的筛选要达到最佳的分离纯化效果，必须正确有效的选用树脂。树脂的选择应从树脂极性、空隙率、孔径等指标，并根据需分离物质的极性及吸附量等影响因素综合考虑。（）吸附量的测定静态吸附法：准确称取经预处理的树脂各适量，置适宜的具塞玻璃器皿中，紧密加入一定浓度的欲分离纯化的物质的水溶液适量，置恒温振荡器上振荡，震动速度一定，定时测定溶液中剩余浓度，直至吸附达到平衡。计算吸附量。（）动态吸附法：将等量已预处理的树脂各适量，装入树脂吸附柱中，待分离物质水溶液以一定的流速通过树脂床，测定流出液的浓度，直至达到吸附平

18、衡计算各树脂的比上柱量（），然后用去离子水清洗树脂床中未被吸附的量，计算树脂的比吸附量（）。（上一残）（上一残一水洗）静态法较动态法简单，可控性强，但动态法更能真实反映实际操作的情况。（）解析率的测定由于树脂极性不同，吸附作用力强弱不同，解吸难易也不同，若吸附过强，解析太难，解析率过低，产品回收率低，损失太大，即使吸附量再大，也无实际意义。静态法：取充分吸附的各种树脂，分别精密加入解吸剂，解吸平衡后，滤过，测定滤液中吸附成分的浓度，根据吸附量计算解吸率。动态法：将解吸剂以一定的速度通过树脂床，同时配合适当的检测方法以确定解析终点，然后测定解吸液中药物的浓度。（）吸附条件的确定上样液的浓度，值，

19、上样液吸附的速度，温度都会影响大孔树脂的吸附能力，现分别介绍：吸附液的浓度吸附液的浓度对大孔树脂的分离纯化影响很大。对于一定量树脂，浓度太低，尽管吸附效率高，但是不能完全发挥树脂的作用，浪费树脂且生产效率低：浓度太北京化大学硕：论文大，树脂的吸附容量增加，但同时泄漏较多，造成浪费所以在生产过程中，为了提高生产效率且不造成浪费，单柱吸附时，上柱液含生药量以在泄漏点附近为宜：若多柱串联吸附上柱液含生药量以接近饱和点为宜。泄漏点的测定方法：将药液按少量多次的原则，在确定的吸附条件下以一定的流速分次通过树脂床，每次收集流出液，按法分析药物组分，若在某一时段收集的流出液中在分析方法误差所允许的条件下，测

20、得该药物组分，则从开始到此时所上样的药液体积总和就是树脂在该吸附条件下对这一药物组分的泄漏点。吸附液的值在大孔树脂的吸附过程中，吸附液的直接影响了溶液的极性，对整个吸附过程中具有重大影响。根据化合物结构的特点调整原液的值，可以达到较好的吸附效果。树脂对某种物质的吸附，特别是对生物碱和黄酮类物质的吸附，很大程度上受它的解离程度的影响。对非极性吸附树脂来讲，酸性物质在酸性条件下，以分子形式存在，易被树脂吸附，而在碱性环境下，以离子形式存在，物质不易被吸附。因此，原液会影响树脂吸附性能。药液上样吸附的速度上柱液上样吸附的速度对树脂的吸附能力也有一定的影响，随着上样液流速的加大，从柱中泄漏出的液体也在

21、不断加大，树脂吸附量在减小。流速过快时，树脂与被吸附物质分子间来不及充分接触，致使分子不能充分扩散到树脂内表面，就随着上样液一起泄露出去，所以造成了随着流速的增加，吸附量下降，泄漏量增大的现象。在实际生产操作中，从尽量缩短吸附时间和增大吸附量的角度出发，应根据不同的吸附柱选择最佳的流速，一般上样时控制流速在卜为宜。吸附温度吸附温度对树脂的吸附有一定的影响，当吸附时间相同时，温度越高，吸附率越高，说明吸附越快，在实际生产中适当升高温度可缩短吸附达饱和的时间，提高效率。（）解吸条件的确定洗脱剂的确定通常所选的解吸剂应对溶质有较大的溶解度，这样可以得到高浓度的洗脱液。通过选用的不同洗脱溶剂，以一定的

22、流速通过树脂床进行解吸，分段收集解吸液，测定浓度，绘制解析曲线，一般解吸曲线越尖锐，不拖尾，解吸率越高。解吸剂的确定根据实际情况，用稀酸或稀碱溶液调节解吸液的值，以一定的流速进行解吸，比较不同值的解吸效果，确定解吸液的。北京化大学硕一论文解吸速度的确定一般流速越慢，解吸率越高，解吸效果好。但解吸速率的选择，还应结合生产周期，综合考虑生产效率和产品纯度，权衡利弊。一般洗脱时控制流速在较为合适。解吸温度的确定在不同的温度下，比较解吸效果一般温度升高，有利于解吸，但温度过高，有可能使一些吸附性过强的杂质成分解吸而混入成品中，影响产品的纯度同时温度的选择也应考虑节能和减少设备腐蚀等因素。大孔吸附树脂操

23、作步骤（）树脂的预处理预处理的目的：为了保证制剂最后用药安全树脂中含有残留的未聚合单体，致孔剂，分散剂和防腐剂对人体有害。预处理的方法：乙醇浸泡一用乙醇洗至流出液与水按：混合不浑浊为止一用水洗至无醇味，备用。（）上样将样品溶于少量水中。以定的流速加到柱的上端进行吸附。上样液以澄清为好，上样前要配合一定的处理工作，如上样液的预先沉淀，滤过处理，调节，使部分杂质在处理过程中除去，以免堵塞树脂床或在洗脱中混入成品上样方法主要有湿法和干法两种。（）洗脱先用水清洗以除去树脂表面或内部还残留的许多非极性或水溶性大的强极性杂（多糖或无机盐），然后用所选洗脱剂在一定的温度下以一定的流速进行洗脱（）再生再生的目

24、的：除去洗脱后残留的强吸附性杂质，以免影响下一次使用过程中对于分离成分的吸附再生的方法：乙醇洗脱至流出液无色透明为止，再用水洗至中性，备用。论文选题的目的和意义一熊果苷在世纪年代由日本资生堂化妆品株式会社作为化妆品美白剂首先推出，它是继半胱氨酸和曲酸等美白剂后又一个美白剂。不仅对皮肤的雀斑、老人斑、黄褐斑有消褪作用，而且对皮肤的滋润、皮肤灼伤后的愈合和北京化工人学硕士论文粉刺等也颇有疗效。一熊果苷作为最新的美容增白剂，世界知名品牌刚刚开始使用。年推出了含有熊果苷的新活性皮肤增白剂，日本资生堂也推出了含有熊果苷成分的系列化妆品。经研究发现一熊果苷对紫外线灼伤所形成的瘢痕具有明显的效果，其化学性质

25、也比一熊果苷效果更为稳定，能够更方便的加入到各种美白亮肤化妆品中。：间最稳定。推荐添加量为之间，可用于所有的配方中。目前发达国家美白护肤市场几乎已被熊果苷垄断。自年通过日本厚生省的认可熊果苷就受了美国和日本大型化壮品厂的密切关注，有人认为对美容品来说世纪将是熊果苷的世纪。熊果苷合成是当前研究工作的一个热点，其合成有种途径：有机合成法、生物转化法和酶合成法。其中有机合成和生物转化法主要用于熊果苷的合成，而酶法合成对于一熊果苷独具优势。对于一熊果苷，化学合成尚未能提供高效立体专一性的合成方法，因为一般合成一糖苷的方法对于合成一熊果苷来说都显得过于繁琐。故一熊果苷一般只能通过不同的微生物的酶进行糖转

26、移反应，让一分子的葡萄糖和一分子的氢醌结合形成单一的一熊果苷。生物法生产符合环保要求，对于合成一熊果苷独具优势，因此吸引了许多研究者的兴趣，相信今后会有更多新的成果应用于实际。但国内这方面的研究进行得很少，值得引起我们的注意。本课题采用微生物菌体为催化剂，催化蔗糖和对苯二酚合成熊果苷，替代以价格昂贵的糖苷酶为催化剂、产物往往是难于分离的一熊果苷和熊果苷混合物的传统工艺，再配合其它工艺条件可制造出纯度高达以上的产品。本工艺具有成本低、产品纯度高、生产操作安全等优点。因此发酵法生产一熊果苷具有重要的现实意义。综上所述，随着人们对于仅熊果苷的研究的不断深入，一熊果苷作为最好的安全高效美白剂必将在国际

27、化妆品中占有极其重要的地位，有着广阔的应用前景。然而，无论是一熊果苷还是熊果苷还未引起我国化妆品界和化工业的足够关注，开发和利用刚处在起步阶段，因此对于生产一熊果苷的深入研究有助于我们紧跟世界化妆品行业的最新潮流，参与全球化商贸竞争。本论文研究内容采用微生物菌体为催化剂，催化蔗糖和对苯二酚合成一熊果苷，替代以价格昂贵的一糖苷酶为催化剂，产物往往是难于分离的一熊果苷和一熊果苷混合物的传统工艺。对此，从三个方面来达到以上目的：北京化人学硕一：论文一是采用一糖苷键专一性强的菌株，在菌种筛选过程中，通过对菌种诱变、复筛，最后得到一株对一糖苷键专一性强的菌株，利用此菌株作为催化剂，催化合成的都是一熊果苷

28、，而不生成一熊果苷；二是通过优化发酵条件，提高一熊果苷产量，优化工艺步骤，实现低成本、大规模生产的目的；三是利用大孔吸附树脂对产物进行分离纯化，首次利用分离效率高、易工业化放大的大孔吸附树脂分离纯化方法，最终获得高纯度的产品。北京化工人学硕士论文第二章黄单胞菌的诱变筛选一熊果苷（）属氢醌苷化合物，化学名为一羟基苯基一一吡喃葡萄糖苷，具有显著的抑制酪氨酸酶活性，减少酪氨酸酶在皮肤中的沉积，对皮肤有美白、防色变和祛斑的功效，是种新型的无刺激、无过敏、配伍性强的天然美白活性物质。在比较一熊果苷与一熊果苷在人体黑色素细胞的实验中，等瞳研究发现一熊果苷的美白效果是一熊果苷的倍以上，而且一熊果苷的美白机理

29、是直接抑制酪氨酸酶活性，不抑制人体细胞：然而相同浓度的一熊果苷却对人体细胞出现了抑制，对使用者有一定的副作用。所以一熊果苷是一种更高效、更安全的美白剂。目前国内对于一熊果苷生产的文献报道较少。随着一熊果苷作为美白剂被越来越多人接受，对它的研究也越来越多，作者通过生物法制备一熊果苷，并对工艺条件进行了讨论。本章通过诱变筛选，获得了一株酶活高、专一性强的菌株，利用该菌株催化合成一熊果苷，产物只有单一结构的一熊果苷，转化率可达到以上，具有重大工业化意义。材料与方法菌种嗜麦芽黄单胞菌（），由本实验室保藏。培养基斜面培养基：蔗糖，蛋白胨，无水，：，琼脂，水定容到，×灭菌。发酵培养基：蔗糖，蛋白

30、胨，无水。，：，：，。，维生素，维生素，烟酸，对氨基苯甲酸纳，水定容到，×灭菌。北京化工大学硕论文材料和仪器设备材料：一熊果苷标准品和一熊果苷标准品为公司提供；其他为分析纯试剂或商业用物品。仪器设备：全温振荡培养箱，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；高效液相色谱，日本岛津；旋转蒸发器从，上海亚荣生化仪器厂；低速大容量离心机型，上海安亭科学仪器厂；立式自动电热压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂。黄单胞菌的诱变从菌种斜面挑一环菌种，加入到无菌生理盐水试管中配成菌悬液，稀释浓度到一，然后加入不同量的化学诱变剂（硫酸二乙酯），在旋涡混合器上振荡，取菌悬液涂平板，把平板放在紫外灯（距离）照射不

31、同时间。把复合诱变后平板放在恒温培养箱中暗培养。以不经过复合诱变平板作为空白对照，其培养后菌落数计为，经过复合诱变平板培养后菌落数计为。计算致死率。致死率（）。然后把复合诱变后菌株分别接种摇瓶发酵。黄单胞菌的初筛把黄单胞菌涂布平板，挑单菌落依次进行摇瓶发酵，发酵后加入对苯二酚和蔗糖反应，最后产物走硅胶薄层层析板（），以标准品作对比，把斑点值与颜色跟标准品一样的菌落挑出保藏。黄单胞菌的复筛把经过初筛的菌株进行摇瓶发酵，发酵后加入对苯二酚和蔗糖反应，最后产物用高效液相（）检测，计算对苯二酚的转化率。北京化大学硕：论文黄单胞菌的培养发酵培养基于三角瓶中，×和灭菌。将菌种斜面挑一环接种到三角

32、瓶中，在。、摇床培养。一熊果苷的生物合成在培养好的黄单胞菌发酵液中加入对苯二酚和蔗糖，、摇床反应。反应方程式：对苯二酚的转化率：转化率（）其中为加入到发酵液中对苯二酚的摩尔量，为反应后发酵液中一熊果苷的摩尔量。一熊果苷的检测胡薄层层析法（法）：把反应后的发酵液用点样毛细管分别取少量样品依次点在板上，以正丁醇、异丙醇、水的体积比：为流动相，对甲氧基苯甲醛、乙醇、浓硫酸的体积比：为显斑剂，在烘箱中烤即可显色。高效液相法（法）：取发酵液，加入甲醇，离心。上清液用高效液相色谱检测。色谱柱：柱，×，；柱温：；流动相：巾（。）：巾（。）：；流速：；检测器：紫外检测器；检测波长：；进样量：。菌浓的

33、测定菌浓用在波长下分光光度计检测的吸光度咖表示。数据处理和分析以下实验所得数据均重复三次，然后取平均值。北京化工大学硕士论文结果与讨论黄单胞菌的诱变以本实验室保藏的嗜麦芽黄单胞菌作为出发菌株，分别实验在菌悬液中于不同紫外照射时间对菌体进行诱变，以不照射紫外线的空白平板作为对照。具体结果参见下表。表黄单胞菌的紫外诱变￥根据微生物发生突变的概率可知，当菌体的致死率在以上时，菌体发生突变的概率最大。由上表结果可知，当紫外照射在秒以上时，菌体致死率可达以上，由此可得秒株、秒株、秒株，总共株作为初筛出发菌株。黄单胞菌的初筛把致死率在以上的平板进行挑单菌落，可得株菌株，依次接种摇瓶发酵，然后加入对苯二酚和

34、蔗糖反应，反应后发酵液用法分析，把斑点，及颜色与标准品一致的菌株挑出保藏。通过对株进行发酵反应，与出发菌株进行对比，结果比出发斑点大的菌株有株，跟出发菌株斑点相近的有株，比出发菌株低的有株。即有株菌株发生了正突变，把这株菌株保藏进入下一轮的复筛。具体结果参见图一及表。北京化上学硕十论史图部分诱变菌株发酵反应厉的薄层层析图（注：最右侧样品为一熊果苷标准品）（：）表发生止突变的株菌株的图编号苗落生长情况备注参比他垢坞”埔坞北京化工大学硕上论文注：“”表示发酵液的菌体密度和斑点大小程度，“”表示斑点明显大于出发菌株斑点。黄单胞菌的复筛把经过初筛获得的株菌株依次进行摇瓶发酵，加入对苯二酚和蔗糖反应，反

35、应后发酵液用法分析，最后得到株转化率在以上的菌株，比出发菌株转化率（）高以上，具体结果如表。由表可知菌株一转化率最高，可达，比出发菌株转化率（）提高了。北京化人学硕：论文菌株继代稳定性实验把菌株一经过连续继代代后，依次把各代进行发酵，继代稳定性结果如图。由图可知，第代菌种活力依然不变，一熊果苷转化率依然高达。由此可见菌株的遗传性状是稳定的。厂、长、蒋、÷婢继代（代）图继代稳定性北京化丁大学硕论文本章小结通过对本实验室保藏的嗜麦芽黄单胞菌（）进行诱变筛选，最后获得一株酶活比出发菌株提高了的菌株，经连续传代稳定性试验证明，该菌株遗传性状稳定，可以作为一熊果苷生产菌株。北京化工人学硕十论文

36、第三章发酵法生产一熊果苷本章研究黄单胞菌发酵法生成一熊果苷，通过对其发酵培养基（碳源、氮源、金属离子及微量元素等）和发酵条件（温度、摇床转速、发酵时间糖等）的研究及分析进行了探讨。材料与方法菌种嗜麦芽黄单胞菌（），由本实验室保藏。培养基斜面培养基：蔗糖，蛋白胨，无水。，：，：，琼脂，水定容到，×灭菌。发酵培养基：蔗糖，蛋白胨，无水，维生素，维生素，烟酸，对氨基苯甲酸纳，水定容到，×灭菌。材料和仪器设备材料：一熊果苷标准品和一熊果苷标准品为公司提供；其他为分析纯试剂或商业用物品。仪器设备：全温振荡培养箱，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；高效液相色谱，日本岛津：旋转蒸发器，上

37、海亚荣生化仪器厂；低速大容量离心机一型，上海安亭科学仪器厂；立式自动电热压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂。北京化大学硕、：论文黄单胞菌的培养发酵培养基于三角瓶中，×和灭菌。将菌种斜面挑一环接种到三角瓶中，在、摇床培养。一熊果苷的生物合成在培养好的黄单胞菌发酵液中加入对苯二酚和蔗糖，、摇床反应。反应方程式：对苯二酚的转化率：转化率（）水其中为加入到发酵液中对苯二酚的摩尔量，为反应后发酵液中一熊果苷的摩尔量。一熊果苷的检测（法）取发酵液，加入甲醇，离心。上清液用高效液相色谱检测。色谱柱：柱，；柱温：；流动相：咖（）：巾（。）：；流速：；检测器：紫外检测器；检测波长：；进样量：。菌浓的测

38、定菌浓用在波长下分光光度计检测的吸光度蛳表示。数据处理和分析以下实验所得数据均重复三次，然后取平均值。北京化大学硕：论文结果与讨论碳源的选择碳源是微生物发酵的一个重要因素，实验分别采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、玉米浆作为碳源，接种菌株发酵，结果如图。、兰彗嘻擗葡萄糖麦芽糖蔗糖淀粉碳源图不司碳源的比较，由图可知，麦芽糖与蔗糖作为碳源菌体催化合成一熊果苷活性最大，对苯二酚转化率高达，而葡萄糖及淀粉转化率却很低，这主要是因为菌体胞内聚合酶对以对苯二酚合成一熊果苷的葡萄糖基有基团选择性。通过分析结果发现，只有含有葡萄糖基的寡糖才能作为所选菌种催化合成一熊果苷的葡萄糖基供体，原因可能是蔗糖（麦芽糖）通过细胞

39、膜上的、泵运输进细胞内，在胞内糖基转移酶作用下转化为果糖和一葡萄糖（两分子一葡萄糖），在转化出葡萄糖分子的同时马上与对苯二酚在聚合酶催化下以，一糖苷键合成一熊果苷；由于淀粉相对分子质量大，通过细胞膜上的、泵无法把它们运输进细胞内，导致胞内聚合酶无法发挥作用，所以转化率很低；对于葡萄糖，因其在水溶液中是以多种结构（如开链葡萄糖、葡萄糖和一葡萄糖等结构）存在，所以虽然葡萄糖分子很容易进入细胞内，但是只有少量的以一葡萄存在的葡萄糖分子占据了酶位点却不能合成一熊果苷，导致最终转化率很低。据文献报道，等人利用黄单胞菌催化合成一熊果苷的反应只能用麦芽糖结构存在的分子才能与对苯二酚在聚合酶催化下合成一熊果苷

40、，而其他结构糖作为反应物，即只能用麦芽糖作为一熊果苷的葡萄糖基的供体。而本项目筛选北京化丁大学硕论文的菌种具有更广阔的葡萄糖基供体，大大地降低了生产成本，为工业化生产奠定了基础。蔗糖浓度的选择由上小节可知，麦芽糖和蔗糖作为菌体发酵的碳源，对一熊果苷的转化率影响不大，从经济角度考虑我们选择价格更低廉、来源更广泛的蔗糖作为碳源。通过比较不同蔗糖浓度对发酵反应的影响，我们试验了蔗糖浓度为、，结果如下图，由图可知，当蔗糖浓度达到时，一熊果苷的转化率最高，为，继续增加浓度对转化率的影响不大，所以蔗糖的最佳浓度为。不耐蔗糖浓度对发酵反应的影响硬静畿加驰们如加了浓度（）图不同蔗糖浓度对发酵反应的影响氮源的选

41、择氮源是微生物发酵的一个重要因素，实验分别采用玉米浆、蛋白胨、酵母膏作为氮源，接种菌株发酵，结果如图，由图可知，蛋白胨作为氮源菌体催化合成一熊果苷活性最大，对苯二酚转化率高达。北京化工大学硕上论文不同氮源对发酵反应的影晌，、誉、，憎卜晕蜒北京化工人学硕：论文发酵温度的影响每一种微生物都有最适的生长温度，根据文献可知，黄单胞菌的最适生长的温度为，所以分别实验培养温度，。一、琶彗、÷辩发酵温度（）图发酵温度对一熊果苷转化率的影响结果如图所示。由图可知，当培养温度为时，一熊果苷的转化率最高，达，继续增加温度转化率逐渐下降，这是因为随着温度的增加，菌体生长受到抑制，不利于菌体的生长代谢，导致

42、转化率下降，所以黄单胞菌的最适生长温度为。发酵时间的选择分别实验了培养时间为、，一熊果苷转化率的比较，实验结果如图，实验结果图表明，当菌体发酵，一熊果苷的转化率高达。而在其他时间时转化率都不是很理想，这主要是因为，在培小时前，菌体尚处于对数期阶段，菌体生物量尚未达到最大值，所以转化率没达到最大值；而当菌体培养后转化率反而逐渐下降，这主要是因为菌体在发酵后处于衰亡期，菌体出现了死亡自溶现象，导致一熊果苷转化率下降。所以菌株一的最佳发酵时间是。北京化工人学硕十论文桨斟却辩发酵时间（）图发酵时间的选择摇床转速的影响菌体发酵转速的大小直接关系到溶氧及代谢物的传质速度。由于黄单胞菌是兼性好氧菌，所以溶氧浓度太低或太高生长代谢均受到阻碍。通过实验不同转速，结果如图，由图可知，摇床转速为时，一熊果苷转化率最高，达。厂、装薅皋辩转。速拶图转速对转化率的影响北京化大学硕上论文值对菌体发酵的影响值为最有利于黄单胞杆菌的生长口，由于在菌体生长过程中会有气体的放出，导