PCR引物设计技巧

1、中国农业科学院蔬菜花卉研究所中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural Sciences PCRPCR引物设计及软件使用技巧引物设计及软件使用技巧 35Sense primerAntisense primer王深浩王深浩中国农业科学院蔬菜花卉研究所中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural Sciences引物设计是引物设计是PCRPCR技术中至关重要的一环

2、技术中至关重要的一环使用不合适的使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：引物容易导致实验失败：a. 非特异性扩增非特异性扩增b. 扩增产物量较少扩增产物量较少c. 无扩增产物无扩增产物中国农业科学院蔬菜花卉研究所中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural Sciences 2.2.引物设计的原则引物设计的原则 1.引物与模板的序列要紧密互补引物与模板的序列要紧密互补2.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构3.引物不能在模板的

3、非目的位点引发引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应聚合反应(即错配即错配)中国农业科学院蔬菜花卉研究所中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural Sciences 引物设计时考虑的因素引物设计时考虑的因素引物长度引物长度 碱基分布的均衡性碱基分布的均衡性TmTm值值引物二级结构引物二级结构引物引物33端端引物引物55端端引物的内部稳定性引物的内部稳定性引物的保守性与特异性引物的保守性与特异性中国农业科学院蔬菜花卉研究所中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute

4、of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural Sciences 常用的是常用的是18-27bp，太短则特异性降低容易引起错太短则特异性降低容易引起错配，太长则结合能量过高，不易结合。配，太长则结合能量过高，不易结合。1. 引物长度引物的长度一般为引物长度引物的长度一般为15-30 bp2. 引物引物GC含量在含量在40%60%间，上下游引物间，上下游引物GC含量含量差异不要太大差异不要太大中国农业科学院蔬菜花卉研究所中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChines

5、e Academy of Agricultural Sciences a. a.引物引物33端的末位使用碱基端的末位使用碱基A A 引物引物33端的末位碱基对端的末位碱基对TaqTaq酶的酶的DNADNA合成效率有较大的合成效率有较大的影响，末位碱基为影响，末位碱基为A A的错配效率明显高于其他的错配效率明显高于其他3 3个碱基个碱基3. 引物的引物的3端端b.b.引物引物33端不要出现端不要出现3 3个以上的连续相同碱基，如个以上的连续相同碱基，如GGG GGG 或或CCCCCC，也会使错误引发机率增加，也会使错误引发机率增加 c. c.引物的延伸从引物的延伸从33端开始，因此端开始，因此3

6、3端的几个碱基与模端的几个碱基与模板板DNADNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致有效的延伸，甚至导致PCRPCR扩增完全失败。扩增完全失败。中国农业科学院蔬菜花卉研究所中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural Sciences 5. PCR反应的反应的Tm值（退火温度）值（退火温度）.一般在一般在5570 之间。之间。（这个温度不同软件的计算差异很大，有时需要实验人（这个温度不同软件的计算差异很大

7、，有时需要实验人员摸索条件）员摸索条件）4.4.引物引物55端端l引物引物55端可以有与模板端可以有与模板DNADNA不配对碱基，在不配对碱基，在55端引入端引入一段非模板依赖性序列，如增加酶切位点等一段非模板依赖性序列，如增加酶切位点等中国农业科学院蔬菜花卉研究所中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural Sciences 6.6.引物中尽量避免发夹结构和引物二聚体的出现。引物中尽量避免发夹结构和引物二聚体的出现。HairpinDimer中国农业科学院蔬菜花卉研究所中国农业

8、科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural Sciences7. 7. 防止引物错误引发（防止引物错误引发（False primingFalse priming）primer1primer1primer2primer2目的区域目的区域中国农业科学院蔬菜花卉研究所中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural Sciences 中国农业科学院蔬菜花卉研究所中国农业科学院蔬

9、菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural Sciences 中国农业科学院蔬菜花卉研究所中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural Sciences 中国农业科学院蔬菜花卉研究所中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural Sciences 中国农业科学院

10、蔬菜花卉研究所中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural Sciences 中国农业科学院蔬菜花卉研究所中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural Sciences Primer Premier 5.0的特点的特点人工操作，精度高对于复杂结构引物设计可以结合试验条件 对引物做出取舍总能设计出引物效率低，不适合大规模设计引物中国农业科学院蔬菜花卉研究所中国农业

11、科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural Sciences中国农业科学院蔬菜花卉研究所中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural Sciences 中国农业科学院蔬菜花卉研究所中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural Sciences 中国农业科学院蔬菜花卉研究所中国农业科学院蔬菜花卉研究所 Institute of Vegetables and FlowersChinese Academy of Agricultural Sciences Primer Prem