植物生理生化指标测定精

1、小黑豆相关生理指标测定1. 表型变化：鲜重、株高、主根长和叶面积鲜重：取处理好的植株,擦干根和叶表面水分，测量整株植物的重量，每个测6个 重复。株高：取处理好的植株，测量从根和茎分隔处到植株最高点的高度，记录，每个测 6个重复。主根长：取处理好的植株，测量从根和茎分隔处到主根最远点长度，记录，每个测 6个重复。叶面积：取处理好的植株，选择第二节段的叶片，测量叶面积，叶面积测量方法是 测每个叶片最宽处长度作为叶的长，测叶片最窄处长度作为叶的宽，叶片长和宽的 乘积即为叶表面积。每个测6个重复。2. 总蛋白、可溶性糖、丙二醛（MDA和H2O2含量测定样品处理:取0.5g样品（叶片要去除叶脉、根要先用

2、清水清洗干净，速在液氮中 冻存,在遇冷的研钵中加液氮研磨，然后加入1.5ml的Tris-HCI （pH7.4抽提，将抽提液 转移到2ml的EP管中,于4C, 12000rpm离心15min ,取上清,保存在-20C下，上清 液可用于总蛋白、丙二醛（MDA、可溶性糖和H2O2含量测定。总蛋白测定（Bradford法：样品反应体系（800ul H2O+200ul Bradford+5ul样品， 空白对照为（800ul H2O+200ul Bradford。测定后带入标准曲线丫=32.549X- 0.224（Y代表蛋白含量,X代表OD595，计算得出蛋白含量。可溶性糖测定：样品反应体系（1ml蒽酮+

3、180ul ddH2O+20ul样品提取液；空白 对照（1ml蒽酮+180ul ddH2O ,测定OD625后带入标准曲线： Y=0.0345X+0.0204（Y代表OD625, X代表可溶性糖含量（ug蒽酮配方：称取100mg蒽酮溶于100ml稀硫酸（76ml浓硫酸+30mlH2O .注意： 浓硫酸加入水中时，一点一点递加，小心溅出受伤。丙二醛（MDA测定:在酸性和高温条件下,丙二醛可与硫代巴比妥（TBA反应生 成红棕色的3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮，在532nm处有最大吸收波长，但该反应受可 溶性糖的极大干扰，糖与TBA的反应产物在532nm处也有吸收，但其最大吸收波长 在450nm

4、处。采用双组分分光光度法，可计算出MDA含量。MDA的计算公式 为:MDA （umol/L =6.45OD532-0.56OD450.反应体系为:400ul 0.6%TBA+350ul H2O+50ul 样品，80C水浴 10min 后，测 OD532 和 OD450。对照用 Tris-HCl.0.6%TBA配方:称取硫代巴比妥0.6g溶于少量1M NaOH中，待其完全 溶解后 用10%TCA（称取10gTCA三氯乙酸，溶于100ml蒸馏水中，待其溶解 即可定容至 100ml。H2O2测定（二甲酚橙法：样品反应体系（82ul溶液A+820ul溶液B （A:B=1:10 +150ul样品提取液,

5、30E水浴30min，测OD560。标准曲线 为:丫=0.01734X- 0.0555（Y 代表 OD560, X 代表 H2O2 含量溶液 A （200ml :FeSO4.7H2O 0.1835g; （NH42SO4 0.0872g; H2SO4浓硫酸 18M4.58ml ,加水定容。溶液B （200ml :二甲酚橙0.0234g 山梨醇6g加水定容到200ml3.可溶性蛋白、SOD、POD和CAT活性测定样品处理:取0.5g样品,速在液氮中冻存，在遇冷的研钵中加液氮研磨，然后加入 1.5ml 的 Tris-HCl （pH7.0 （内含有 20%甘油、1mmol/L ASA（抗坏血 酸、1m

6、mol/L DTT（二硫苏糖醇、1mmol/L EDTA、1mmol/L GSH（还原型谷胱甘肽、5mmol/L MgCl2抽提，将抽提液转移到2ml的EP管中，于4C , 12000rpm离心15min ,取上清, 保存在-20r下,上清液可用于可溶性蛋白、SOD、POD和CAT含量测定。1mmol/L的ASA配制:先配制10mmol/L的母液一称取176.13mg的ASA ,溶于 100ml的Tris-HCI （pH7.0中即可，然后稀释10倍即可。1mmoI/L的DTT配制:先配制10mmol/L的母液一称取154.25mg的DDT溶于 100 ml的Tris-HCl （pH7.0中即可

7、，然后稀释10倍即可。1mmol/L 的 EDTA 配制:用 30mmol/L 的 EDTA 稀释 30倍即可。5mmol/L 的 MgCI2 配制:称取 MgCI2.6H2O 的 101.5mg 溶于 100ml 的 Tris-HCl(pH7.0，即可。样品提取液的配制（200ml :取10mmol/L的ASA母液20ml , 10mmol/L的母液DTT20ml ,取 30mmol/L 的 EDTA 母液 7ml ,称取 203mg 的 MgCI2.6H2O ,最后再量 取20ml的甘油，将最终体积定容到200ml，即可。可溶性蛋白测定（Bradford法:样品反应体系（800ul H2O

8、+200uIBradford+5ul样品，空白对照为（800ul H2O+200uI Bradford。测定后带入标准 曲线 丫=32.549X-0.224（Y代表蛋白含量,X代表OD595，计算得出蛋白含量。SOD测定:SOD活性的测定是根据照光时，体系中产生氧自由基使硝基四 唑蓝 还原成蓝色甲（在 560nm处有一吸收峰，而超氧化物歧化酶作为氧自由基 的清除剂 可抑制此反应。？ 一个酶活单位定义为将硝基四唑蓝的还原抑制到对照一半（50% 时所需的酶量。14.5mmoI/L的dl-甲硫氨酸（分子量149.21 （现用现配：称取甲硫氨酸216.4mg , 加少量Tris-HCI（pH7.0溶解

9、后,用Tris-HCI（pH7.0定容到100ml，即 可。30mmoI/L的EDTA （292.25 （现用现配：称取EDTA药品876.75mg力卩少量Tris-HCI（pH7.0 溶解后，用 Tris-HCI（pH7.0 定容到 100ml ,即可。2.25mmoI/L的NBT （硝基四唑蓝（817.6 （现用现配：称取NBT药品183.96mg ,加少量Tris-HCI（pH7.0溶解后,用Tris-HCI（pH7.0定容到100ml，即 可60umol/L的核黄素（376.36现用现配：先称取225.81mg的核黄素,加少量50mM Tris-HCI（pH7.4 溶解后,用 50mM

10、 Tris-HCI（pH7.4 定容到 10ml ,配制成 60mmoI/L的母液 然后取100ul到100ml的Tris-HCl（pH7.4中，即可配制成60umol/L 的核黄素。测酶活的反应介质：测定前在54ml的14.5mmol/L的dl-甲硫氨酸中分别加 入 EDTA、NBT和核黄素各2ml ,此为反应混合液。酶活测定:在盛有1.0ml反应液的试管中,加入适量的酶液（50ul （以抑制达50% 作用酶浓度为最佳。混匀后放在透明的试管架上，于光照培养箱中准 确照光10min 后，迅速测定560nm处的光密度。以不加酶液照光液的为对照，计算反应被抑制的 百分比。按下式计算超氧化物歧化酶的

11、活性 A N酶活力=AOK W XT >V >50%式中:酶活力单位为每min每g鲜重酶活单位数；AO为对照试管溶液在560nm处的吸光度值； A为对照试管溶液在560nm处的吸光值与加入酶液的反应液在 560nm处 的吸光值的差；N为酶液总体积；W为提取酶液的样品鲜重g ; T为照光时间（10min; V为加入酶液的体积（ml;POD测定（愈创木酚法：过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。 在有 过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计 测量生成物的含量。反应混合液配制：在50ml的50mmol/L的Tris-HCI(pH7.0缓冲液中加入2

12、8ul的 愈创木酚，与磁力搅拌器上加热搅拌直至愈创木酚溶解，再加入19ul的30%的H2O2, 混合均匀，4C保存。酶活测定:取反应混合液1.0ml ,加入0.1ml酶提取液，2min前后，于470nm处测 OD值，每隔1min读数一次，以每分钟OD值的变化表示酶活大小。(测量时再加入 酶液CAT测定(H2O2法反应缓冲液:20mM的H2O2,使用前在25C水浴中加热30min。酶活测定:取反应液1.4ml，加入100ul酶液,每加完一管立即计时，并迅速在波长 240nm下测定30S、1min30S、2min30S时的吸光度，以Tris-HCl的作为空白。以 1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位。代入酶活力公式,以 OD*V/0.1*v*t FW 表示CAT活性,所有测定均重复三次。 OD代表空白的吸光度-样品管的吸光度；V代表酶提取液的总体积，v代表测量是加入的样 品体积;t代 表反应时间min , FW代表样品鲜重。0.1mol/LH2O2 配方:称取 1.1333g 的 30%的 H2O2,加入 100ml 的 50mmol/L 的 Tris-HCl(pH7.4,即可。也可以用 0.01%的 H2O2。4