石蜡切片的具体步骤与做法

1、石蜡切片的具体步骤与做法?石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法，因此用得最多，它有很多优点：比较省时间，容易操作，可切成极薄的切片（4um以下），能制作连续切片，组织块可包埋在石蜡中永久保存。缺点是只能用于较小的组织块，较大的组织块不易切好，容易破碎，组 织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。制片时间太长。石蜡切片的制作过程（一）材料与用具|1 材料：鱼皮肤、性腺、肠、肝胰脏等。2 用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。（二）实验内容与步骤1 .取材及固定取动物体上的小块组织成为组织块。组织块的大小以不超过0.5立方厘米为宜。切去组织块

2、时动作要轻，切忌用力牵引或挟持，以免组织内部发生变化。组织块取下后，先用先用 0.85 %的生理盐水漂洗以戏曲血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物 洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24小时。如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。材料由动物体取下后应当迅速固定，固定的目的是尽快使固定液渗入组织内部，将组织固定，以保持其原有的结构。不同的组织应选用适当的固定液。固定液的用量与组织块体积之比一般在20 : 1。不应使组织块贴

3、于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。2 .冲洗固定后的组织块在进行脱水前必须用流水洗去固定液。组织块应用纱布包好，注名，放金属水洗网中用流水冲洗，甲醛固定液固定的组织一般水洗24小时，Bouins固定液固定的组织水洗 24小时。AFA固定液则不需要水洗。|3 .脱水和硬化经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中 的水。脱水必须充分，脱水不充分会影响透

4、明和浸蜡。脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会 引起组织块强烈的收缩变形。脱水所用的酒精浓度及过程如下：30 %> 50 %> 70 %> 80 %> 90 %> 95 % > 100 % （I ）> 100 % （ II）组织块在各级较低浓酒精（小于 70 %）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过0.5立方厘米的组织块脱水时间为612小时，在高浓度酒精中（大于 70 %）脱水时间为3小时左右。组织块在无水酒精 中需经过两次处理，以保证脱净水分。由于无水酒精有使组织变脆的缺点，故在无水酒精中脱水的时间不 宜过长，一般应在1530分钟左右

5、。在脱水瓶中酒精的量与组织块之比约为50 : 1。简化步骤如下：70% （一夜）80% （1小时）90% （30分）95% （30分）100% （ 15分）酒精+ 二甲苯（15分）二甲苯（3分）石蜡+二甲苯（30分）石蜡（80分）4 透明透明是石蜡切片法切片前必经的一步。其目的在于用矿物油或植物油等透明剂置换出无水酒精，以便于熔 化的石蜡浸渗到组织间隙中，故透明剂必须是能分别与石蜡和酒精相溶的。经过透明剂处理的组织块用肉 眼对光观察呈透明现象，所以这个过程称为透明。常用的透明剂有二甲苯、苯、甲苯等，这些都是穿透力强易使组织变脆的透明剂，因此透明的时间宜短， 一般在20分钟即可。透明时组织块由无

6、水酒精中取出，先放入二甲苯和无水酒精等量混合的溶剂中1小时左右，然后取出放入纯二甲苯中20分钟即可。5 浸渗浸渗过程是使包埋组织用的物质深入到所有的组织间隙中，然后再通过各种方法使这种物质凝固，而将组 织材料包埋其中。石蜡切片法和火棉胶切片法都需要浸渗过程。石蜡切片法是将加热的石蜡渗到组织中而火棉胶切片法是使 火棉胶渗到组织间隙中去。在浸渗前要先将选好的石蜡分别以容器装好放在恒温箱中，使其杂质沉淀。石蜡最好选用软蜡和硬蜡两种，软蜡熔点为4550C之间，硬蜡熔点为 5658 'C之间，6062 'C的硬蜡很少用。冬天室温较低时多用软 蜡，夏天室温较高时多用硬蜡。浸渗应在自动恒温箱

7、中进行。组织块在各个蜡杯中浸蜡的时间如下：软蜡1 30min软蜡2 30min硬蜡1 3060min硬蜡2 60120min这一时间不是固定不变的，应视组织块的种类及大小而相应延长或缩短浸蜡时间。浸蜡的总时间一般为：0.5立方厘米的组织块时间为 68小时；0.20.3立方厘米的组织块时间为 35小时；0.10.2立方厘 米的组织块时间为23小时。当发现蜡杯中有灰尘或组织碎块时应使其沉淀或过滤后再使用。浸蜡不透包埋后会岀现白色不透明部分，此时需要在浸蜡一次。6 .包埋包埋就是将已经浸渗好的组织块包埋于浸渗剂中，石蜡包埋法如下。浸蜡终了时，将预先预热好的和第四杯石蜡相同熔点的石蜡倒入折好的蜡槽内，

8、然后从第四个蜡杯中取岀 组织块，放入蜡槽内，摆好位置，注意组织切面的摆放方向。放好组织后可以自然冷却，也可以放入冷水 中直接冷却。7.塑型和切片取已经包埋好的蜡块，将纸盒拆下，用加热的刀片或解剖刀将其分成若干块（每块组织占一块），用解剖刀将组织块周围多余的石蜡切去，注意不要切到组织。把有组织的蜡块修成正方形或梯形。在进行塑型时一 定要注意组织块切面的方向。蜡块塑好后将其粘在小木块上。注意要粘牢。最后在木块侧面用铅笔记上组 织块名称、编号。|切片时采用手摇连续切片机。使用切片机进行切片时，将蜡块固定在切片机上，调好距离和所要求的切片 厚度，然后用右手摇动手柄，即可进行切片了。一般来讲生物切片的厚

9、度在510微米。对于切下的切片不要用手去取，因为体温可以使蜡片粘到手上，正确的做法是用毛笔或牙签挑取，然后放 在载玻片上进行展片和粘片。8展片和粘片切下的组织蜡片往往带有皱褶，所以在染色前必须进行蜡片的展片和粘片，即把切好的蜡片平整的粘在载玻片上。展片的温度因石蜡熔点的不同而的不同，一般的5658 C的石蜡切片C的温水进行展片，4852 C的石蜡切片用35 C的温水进行展片。等到蜡片充分展平后，取一清洁载玻片，载玻片上涂一薄层蛋白甘油， 然后在水中捞取蜡片，捞完后将蜡片摆正，放到格盘内，置38 C温箱中烘干，然后即可进行染色。展片和粘片比较简单容易做，但是如果处理不好则无法进行染色，即使能染上

10、色，组织切片内部的结构也 往往被破坏。9.染色和封固为了观察组织内部的细微结构，必须应用某些与固定后的原生质有亲合性的染料，对组织进行染色，否则有碍观察。普通的染色法有两种即苏木紫伊红染色法(简写为H?E )染色结果是细胞核为紫色，细胞质为粉红色；另一种方法为铁苏木紫染色(简写为 I?A)，染色的结果是全部着以深浅不同的蓝色。苏木紫伊红染色法整个染色过程如下：取已经干燥的切片，放于盛有二甲苯的染缸内脱蜡10min左右，这个过程称为脱蜡。脱完蜡后的切片即可进行染色，具体染色过程和时间如下：(1) 100 %酒精洗去二甲苯 25min。(2) 95 %酒精 2 5min。(3) 90 %酒精 2

11、5min。(4) 80 %酒精 2 5min。(5) 70 %酒精 2 5min。(6) 50 %酒精 2 5min。(7 )蒸馏水洗25min。(8)苏木紫染液1020min。(9 )普通水洗1min。(10) 盐酸酒精分色数秒半分钟(70%酒精100ml +盐酸1ml)，分色到切片为带粉红色后立即取出。(11) 自来水冲洗数小时。镜检切片呈清朗的蓝色，细胞核非常明显。(12 )蒸馏水洗1min。(13) 50 %酒精 25min。(14) 70 %酒精 25min。(15) 80 %酒精 25min。(16 )伊红酒精溶液对比染色25min ( 95 %酒精+ 0.5g伊红)。(17) 9

12、5 %酒精 25min。(18 )无水酒精I 3min。(19 )无水酒精U 3min。(20 )无水酒精加等量二甲苯2min。(21) 二甲苯数分钟到透明为止。(22) 自二甲苯中取出切片，放在格板内，滴少量的树胶于组织片中央。(23) 取一盖玻片，轻轻以盖玻片的一边接近载玻片，然后迅速放下盖玻片，树胶即迅速扩张到四周，校 正好盖玻片方向。将封好的切片放置在恒温箱中干燥。最后，将干燥好的切片上的浮色擦净，并在玻片的左端粘上标签，注明组织切片的名称、染色方法、固定 方法、年月日。(三) 药品的配制1 配制各级浓度的酒精(见下表)所用酒精浓度欲配酒精浓度95 % 90 % 85 % 80 % 7

13、5 % 70 % 65 % 60 % 55 % 50 %90 % 6.585 % 13.36 6.5680 % 20.1 13.79 6.8675 % 29.66 21.89 14.48 7.2070 % 39.16 31.05 23.14 15.35 7.6465 % 50.66 41.53 33.03 24.66 16.37 8.1560 % 63.16 53.65 44.48 35.44 26.47 17.58 8.7655 % 78.36 67.87 57.90 48.07 38.32 28.63 19.02 9.4750 % 96.13 84.71 73.90 63.04 52.43 41.73 31.25 20.47 10.3545 % 46.09 34.46 22.90 11.4140 %35 %30 %2 .配制各种固定液常用的固定液为波恩氏(Bouin ')固定液。配制方法如下：苦味酸饱和水溶液75ml甲醛25ml冰醋酸5ml3 蛋白胶亦称梅氏蛋白的制作将鸡蛋一个打破让蛋清流入烧杯内，用筷子充分条大雪花状泡沫，然后将它用双层纱布过滤到量筒中，经 数小时或一夜，过滤岀透明的蛋白液，此时再加入等量的甘油，稍稍振摇使两者混合，最后加入麝香草酚(thymol ) (1 : 100 )做防腐作用，可保存几个月到