唾液淀粉酶的性质和活力测定

1、唾液淀粉酶的性质和活力测定一实验目的（一）1 通过唾液淀粉酶性质的测定，了解酶的专一性和多种因素对酶粗反应的影响，pH，底物浓度，温度，激活剂，抑制剂等2 学习酶活力， 酶活力单位， 比活力的测定， 加深对概念的理解；3 学会用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量，学会用3,5-二硝基水杨酸测定还原糖的含量，熟练操作分光光度计。二实验试剂和器材器材：可见光分光光度计，试管，移液管，恒温水浴锅， pH 试 纸，1000ml容量瓶和100ml的容量瓶各一只；药品：可溶性淀粉，考马斯亮蓝试剂 G-250， 3,5-二硝基水杨酸， NaoH,HCL ，标准牛血清白蛋白溶液，醋酸，醋酸钠，蒸馏水， 95% 乙醇

2、，85%磷,;0.15molNaCL/ml, 0.15mol/L硫酸铜溶液，碘化钾- 碘溶液：将碘化钾 20克和碘 10 克溶解在 100ml 水中，使用前稀释 10倍。注：（1 ）考马斯亮蓝 G-250 试剂：考马斯亮蓝试剂 G-250100mg 溶于95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，加水稀释至1000ml,过滤即 可。（2）标准牛血清白蛋白溶液：结晶牛血清白蛋白用凯式定氮法 测蛋白含量，根据其纯度用 0.15mol/L Nacl 配置成 0.1mg/L 的蛋白液；（3）配置 0.01%g/ml,0.1%g/ml,，0.5%g/ml,1%g/ml,2%g/ml,3%g/ml 的的溶性淀

3、粉溶液 ;（4）配置一系列pH2的缓冲溶液0.2MOI/L磷酸氢二钠溶液为28.40g/L,Mr=141.98,称取2.84g溶于100ml的水 中0.1MOI/L 柠檬酸溶液 21.01g/I,Mr=210.14,称取 2.1 溶于 100ml 水中;锥形瓶号0.2MOI/L磷酸氢二钠（毫升）0.1MOI/L柠檬酸（毫升）缓冲液pH10.419.602.224.1115.893.037.7112.294.0410.309.705.0511.158.855.4612.097.915.8713.226.786.2814.555.456.6916.473.537.01018.171.837.411

4、19.150.857.81219.450.558.05配置0.15moI/L的NaCL溶液和0.15moI/L硫酸铜溶液三.实验步骤（一）1 pH的对酶的影响1）葡萄糖标准曲线的制定准确称取100mgAR纯的葡萄糖，溶于蒸馏水中，定容于 100ml的容量瓶中，配成1.0mg/L的溶液，水浴加热5min，迅速取出冷却，在向每管加入21.5ml的蒸馏水于550nm处测吸光度;试剂处管W01234567葡萄糖标准液/ml0.20.40.60.81.01.21.4蒸馏水/ml2.01.81.61.41.21.00.80.63,5-二硝基水杨酸/ml1.51.51.51.51.51.51.51.5入=5

5、50nm的吸光值（A）2）取一试管加入 2ml 淀粉并滴加两滴碘液， 加入适量的酶， 记录 溶液颜色退去的时间，作为接下来各步反应的反应时间t；3）取十二只试管并编号分别加入 2ml 缓冲液加入 2ml， 0.1%淀粉，再加入适量的酶，反应 t 后加入 3,5-二硝基水杨酸1.5毫升，水浴加热5min,迅速取出冷却，在向每管加入21.5ml 的蒸馏水于550nm处测吸光度；4）由 pH 值和吸光度做曲线，找出最适 pH 值2 温度对酶活性的影响1）取十只试管并编号，分别加入 2ml， 0.1%淀粉液和相同量的酶同 时置于 0-100，温度间隔 10 度，反应 t 后加入 3,5-二硝基水杨酸

6、1.5 毫升，水浴加热5min，迅速取出冷却，在向每管加入 21.5ml的蒸馏 水于550nm处测吸光度；2）由吸光度和温度做曲线，找出最适温度值3 底物浓度对酶活性的影响1）取十只试管并编号并编号 1-10，由 1,2 步知最适温度和最适 PH 调 节温度 PH 值至最合适，然后分别加入 0.01%g/ml,0.1%g/ml,， 0.5%g/ml,1%g/ml,2%g/ml,3%g/ml 淀粉溶液 2ml 并加入等量的酶，反 应t后加入3,5-二硝基水杨酸1.5毫升，水浴加热5min，迅速取出冷 却，在向每管加入21.5ml的蒸馏水于550nm处测吸光度；2）做吸光度和底物浓度的曲线图，找出

7、最适底物浓度；4 激活剂和抑制剂对酶活性的影响取三试管并编号123，分别加入2ml0.1%淀粉溶液，加入最适pH值 的缓冲液并在最适温度水浴中保温 5min后加入1m稀释的唾液淀粉酶，T时间加入3,5-二硝基水杨酸1.5毫 升，水浴加热5min,迅速取出冷却，在向每管加入 21.5ml的蒸馏水 于550nm处测吸光度；比较吸光度的大小；（二）酶活力和比活力的测定1）蛋白质标准曲线的制作取十二只试管平行操作试管编号0123450.1mg/l标准蛋 白质溶液/ml0.010.030.050.070.09考马斯亮蓝G-250试剂1.001.001.001.001.001.000.15molNaCL/ml0.100.090.070.050.030.01混匀，1h以内已0号试管为空白对照，在595nm处比色A2）用标准蛋白质质量为横坐标，吸光度为纵坐标做标准曲线3）定义：酶活力单位：每分钟生成1mg葡萄糖所需的酶量4） 取一只试管加入一定的酶液（用移液器）加入考马斯亮蓝G-250试剂1.00ml，并和0号管对比，加0.15mol/LnaCL是液面齐平，混匀，1h以内已0号试管为空白对照，在595nm处比色测吸光度；5）根据蛋白质标准曲线求出酶蛋