动物细胞血涂片备

1、动物细胞血涂片的制备.瑞氏染液及细胞观察一、实验目的a）学习涂片制备的一般方法b）学习瑞氏染色的方法C）学习辨认各种血细胞二、实验原理a）血涂片的简介血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极广泛， 特别是对于各血液病的诊断具有重要的价值。血涂片制备时手工推片法 用血量少、操作简单，是最广泛应用的方法。血涂片制备是血液学检查 的重要基本技术之一。一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显， 细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。b）血涂片的制备及瑞氏染液的配制用推片法将血液制成薄的血涂片，使血细胞成单层排列。瑞氏染料是山碱性染料天青（Methvlemblue ）和酸性染

2、料伊红（Eostm Y ）合称伊红天青 染料即瑞氏（天青一伊红Y）染料o屮醇作瑞氏染 料溶剂，即成瑞氏染液。（注：屮醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在 一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时山 于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。）c）细胞染色的原理细胞的染色既有物理的吸附作用，乂有化学的亲和作用，各种细胞成分 化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，在同一血片上， 可以看到各种不同的色彩。例如：嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称 为嗜酸性物质；细胞核蛋口为酸性，与碱性染料天青结合，染紫蓝色， 称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状

3、态与伊红和天青均不易结合，染淡 紫色，称为中性物质。d）哺乳动物各类血细胞特点1. 红细胞：圆饼状无核，中间薄，周围厚；数量最多。ii. 淋巴细胞：基本为圆形，比红细胞稍大；核儿乎占据整个细胞，一侧常有小凹陷，染色呈很深的紫色；胞质很少，仅在细胞核外有一 薄圈，儿乎无色。iii. 单核细胞：最大、少、胞体为圆形或椭圆形；胞核形态多样，有卵 圆形、肾形、马蹄形等，常偏位，着色比淋巴细胞核浅；核质比小 于淋巴细胞。iv. 嗜中性粒细胞：基本为圆形，比红细胞和淋巴细胞大，但比单核细胞小；核长，为腊肠状或分叶状（2-5叶），经常很难分辨。v. 嗜酸性粒细胞：胞体为圆形，有一个大而染成淡紫色的核；胞质充

4、满粗大的嗜酸性颗粒（红色）；由于核占据了细胞的很大一部分，使 颗粒在整个细胞内的分布并不均匀。vi. 嗜碱性粒细胞：细胞呈圆形，胞质内有大量小的嗜碱性颗粒，呈蓝 紫色，分布于整个细胞，覆盖核。vii血小板：最小，多角形聚集成群。e）牛蛙各类血细胞特点i. 红细胞：椭圆形，有核，最大。ii. 淋巴细胞：特征同哺乳动物的淋巴细胞，但是为血细胞中最小的一种。iii. 单核细胞：细胞形态不规则；核偏位，占整个细胞的1/2-2/3。iv. 嗜酸性粒细胞：细胞呈圆形或卵圆形，大小差别比较大，有的比红细胞还大，有的与其他两种粒细胞大小接近；核很大，位于细胞中 央或一侧，呈肾形或卵圆形，也有分叶状、环状，染色

5、为淡紫红色； 胞浆充满红色圆形颗粒，排列紧密。v. 嗜碱性粒细胞：数量极少，细胞为圆形；胞质中充满蓝色或深紫色圆形颗粒，颗粒大小不一，常掩盖核。vi. 嗜中性粒细胞：细胞为圆形或卵圆形；核偏位，形状不规则，具有多样性，有肾形、带状、弯月状或分成两叶至多叶，胞核染色为紫 红色；胞质着色较浅，其中有淡蓝色颗粒状物质不均匀地分布在胞 质内，有时颗粒状物质不十分明显。三、实验材料及试剂a）材料新鲜采集的牛蛙血（采集时加入肝素钠溶液抗凝）。（山老师完成）b）试剂i. 肝素钠溶液：用生理盐水配成180IU/mLo （由老师配制）ii. 瑞氏染液：瑞氏染料粉末Olg和甲醇60mL。配法：把染料放在研钵内，加

6、入少量甲醇研磨，使染料洛解，然后把溶解的染料倒入干净 的棕色的玻璃瓶当中，并至用完甲醇为止。（由老师配制）iii. PH6.4的PBS：磷酸二氢钾（无水）0. 3g,磷酸二氢钠（无水）0. 2g, 加入少量蒸憎水溶解并定容至lOOOmLo （由老师配制）C）用品普通光学显微镜、酒精棉、蜡笔、载玻片等。四、实验步骤流程：清洁一加样一推片一干片一选区一染色一洗片a）清洁载玻片：载玻片在使用之前用酒精棉清洁晾干。b）加样:在干净的载玻片长轴一端离边缘约1cm处的中央用胶头滴管滴1/5 滴血。取另一张干净的载玻片作为推片，让推片的一端先出于血滴推片方向 的前侧，并与血滴玻片成3345夹角。c）推片：先

7、将推片向后拉至血滴处，待血液沿着两块载玻片接触线向两边 扩散后，将推片保持夹角，向血玻片左侧均速推进，血液随推片而行，在血 玻片上形成一层血膜，即为血涂片d）干片：推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。e）选区：在显微镜下观察，寻找涂片中均匀分散良好的血膜，用蜡笔在四 周画线（多画儿圈），作为提防。f）染色:滴加适量的瑞氏染液覆盖选定区域，染1分钟；在滴加等量的PH6. 4的PBS缓冲液稀释染液，轻摇混匀，液面浮现一层金黃色金属物质，然后静 置染色15-20minog）洗去多余染液:用流水或滴加蒸憎水直接洗去浮液。（不要先将染液倒掉） 将载玻片自然晾干，用于观察。h）观察辨认各种细胞。五、实

8、验结果上图中的1框内的细胞形状不规则，且核偏位，占整个细胞的2/3左右。所 以，我认为它是单核细胞。上图中的2框内的细胞圆饼状、有核，且与其他细胞相比最大，而且在视野 当中的数量明显比其他细胞多。所以，我认为它是牛蛙的红细胞。b）上图中的1框内的细胞中有大量的深紫色碱性颗粒。所以，老师认为它是嗜 碱性粒细胞。（但是，因为细胞中的颗粒状物质并没有掩盖核，所以我开始 的时候以为这个细胞是嗜中性粒细胞。山上可知，嗜中性粒细胞与嗜碱性粒 细胞之间的分界线并不是非常的明显。）上图中的2框内的细胞首先比周围其他的细胞都小，基本为圆形，核儿乎占 据整个细胞，而且细胞质很少，且基本无色。所以，我认为它是淋巴细

9、胞。C）且细胞质着色比周围的细胞着色都浅。所以我认为它是嗜中性粒细胞。d）上图中的1框内的细胞呈卵圆形，细胞的左上部分为染成淡紫红色的肾形细 胞核，右下部分为排列紧密的红色颗粒状物质。所以我认为它是嗜酸性粒细 胞。上图中的2框内的细胞，我认为是嗜中性粒细胞（但是我不知道是不是正确）。六. 实验结论及分析 实验中我并没有真的找到嗜中性粒细胞。是在实验后查看所拍的图片的时候 觉得上图细胞有一些像嗜中性粒细胞而已。我觉得，自己的推片还是有一定问题，有些载玻片细胞的细胞分布非常不均 匀，根本就不能用。有一些可能是推片太厚了，所以晾干比较慢，所以在最 后观察时很多红细胞都已经皱缩了。另外，我觉得染色的效

10、果也不是非常理想，红色和紫色的区分并不是非常的 明显。七、实验注意事项a）血量不能多，标本过厚，细胞重叠不便观察，并且造成细胞皱缩变形。b）染液PH值是6. 4-6. 8,染色偏酸或偏碱都会使染色反应异常。PH对细胞 染色有影响。山于蛋口质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸 性环境中下在正电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电 荷增多，易与天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敬感, 染色用片必须清洁，无酸碱污染。配制瑞氏染液时必须用优质甲醇，稀释染 色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常， 以致识别困难，甚至造成错误。c）冲洗时不能先倒掉染液，以防染料沉着在血涂片上；冲洗时间不能过久， 以防脱色。如血涂片上有染料颗粒沉积就，可滴加甲醇，然后立即用流水冲 洗。d）血