伤寒杆菌试验室断

1、作者:日期:伤寒杆菌实验室诊断研究进展来源：中国论文下载中心 07-12-24 11:56:00 作者：黄永亮 编辑：studa20【关键词】伤寒杆菌；检测方法；实验室诊断伤寒是由伤寒杆菌引起的肠道传染病，除引起肠道病变外，还能导致其他器官或全身感染，严重威胁人民的健康。伤寒杆菌的诊断 依据主要为临床症状及实验室诊断。肥达试验和细菌培养是诊断伤寒杆菌的传统方法，但敏感性低且费时。近年来出现的免疫学检测方 法和聚合酶链反应技术具有较高的特异性和敏感性，且操作简单、快速。本文就伤寒杆菌实验室诊断方法综述如下。1细菌培养培养是最常用确诊伤寒的诊断依据，由于特异性高，不出现假阳性而被称为金标准。血液和

2、骨髓穿剌液先用亚硒酸盐胱氨酸增菌液进行增菌培养，粪、尿可直接接种于SS培养基，经历37C 24 h培养后从SS培养基上挑取较小的无色或淡黄色菌落，首先进行革兰染色镜检，镜下为革兰染色阴性，呈短杆状，无芽胞，无荚膜。挑选可疑菌落，接种双糖铁，作血清学鉴定为沙门菌属D组后，进一步作生化反应，即伤寒杆菌不分解乳糖、蔗糖及鼠李糖，能分解葡萄糖，产酸不产气，赖氨酸脱羧酶阳性，谷氨酸脱羧酶阴性，甲基红试验 阳性。副伤寒杆菌形态与伤寒杆菌相似，能分解葡萄糖，产酸产气。临床上伤寒患者在体温上升阶段，在抗生素应用之前作血培养，阳性率可在80%以上，在发病第2周、第3周，粪便培养阳性率可达到60%。培养结果容易受

3、抗生素、培养条件、标本采集的质、量和时间等多因素 影响，带菌者检出率较低，结果报告也常需3 d5d的时间。2血清学反应肥达试验是常用于辅助诊断伤寒的传统方法。其原理是用伤寒杆菌的菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原以及副伤寒甲、乙、丙菌液与稀释的待测血清反应，根据凝集效价判断血清中有无伤寒杆菌的抗体。伤寒病发作后，约在第5天出现O抗体，第10天第12天产生H抗体。早期肥达试验需要急性期和大约间隔10天的康复期血清，两份标本之间抗O抗体或抗H抗体滴度升高4倍，更有诊断意义。伤寒杆菌的O抗原与A群、B群沙门氏菌有部分相同抗原，与甲、乙两种副伤寒杆菌有一定的交叉反应，因此，肥达反应诊断伤寒杆菌 常出现假阳

4、性，特异性差，敏感性低，而且抗原抗体结合出现凝集沉淀常需要20h以上。3免疫学方法3.1酶联免疫吸咐试验（ELISA）根据抗原或抗体特异性免疫反应原理设计，将已知的抗原或抗体结合在某种固相载体上，以辣根过 氧化酶为指示剂，标记在另一种抗原或抗体上，加入酶作用底物，酶与底物发生反应后，底物显色，根据底物显色的深浅定性或定量地 检测样本中的抗体或抗原。3.1.1双抗体夹心ELISA法检测的是血清中的伤寒杆菌或伤寒杆菌抗原。其原理是：用于包被的抗体和酶标记的抗体是针对伤寒 杆菌鞭毛抗原（H抗原）的单克隆抗体。与甲、乙、丙型副伤寒杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌等 无交叉反

5、应，但伤寒杆菌 H抗原仅有的第一相（d）,与斯坦利等一些罕见的沙门氏菌有相同的相位，斯坦利菌虽然不引起类似伤寒的疾 病，但可使结果出现假阳性；据 文献报道有少数健康人血清也能使双抗体夹心法的结果呈阳性1。因此，ELISA法特异性有一定的局限性，阳性结果表明有伤寒杆菌或伤寒抗原存在的可能性，但此法敏感性高，阴性结果可靠。该方法操作简便釣40 min即能报告结果，具有早期诊断价值，适用于疾病预防部门对从业人员定期检测伤寒杆菌带菌者，追踪传染源，在流行病学上有重要意义。3.1.2斑点酶联免疫吸附试验（Dot ELISA ） Dot ELISA的基本原理是双抗原夹心法。伤寒杆菌的脂多糖（ LPS）即O

6、抗原能剌 激机体产生IgM抗体，H抗原能刺激机体产生IgG抗体。通过检测患者血清中的IgM、IgG抗体，即可知道是否感染了伤寒杆菌。Cardona Castro 2等以硝酸纤维素膜为载体，用伤寒杆菌的IgG、IgM抗原包被，利用微孔滤膜的可过滤性使抗原抗体发生反应，建立Dot ELISA试验。对102例伤寒患者在发病不同的时间段进行检测，结果显示，IgG抗体的敏感性和和特异性分别为88%和88% , IgM抗体的敏感性和特异性分别为12.1%和97%。Khan : 3等用Dot ELISA法对128例疑似伤寒患者进行检测，以骨髓培养为金标准，Dot ELISA法的敏感性和特异性分别为71%和4

7、3%。文献报道Dot ELISA法的敏感性和特异性的差异较大，可能与研究者研究的对象和IgM、IgG抗体在患者体内产生的时间有关。3.2浸染试验（Dipstick assay） 又称快速试纸法。Dipstick是近年发展起来的一种用胶体金作指示剂的快速诊断方法。基本原理是 先将特异性的抗原或单克隆抗体固定于试纸条（硝酸纤维薄膜）的一端，检测时将试纸条的另一端浸入待测样品，由于毛细管作用，样 品液向前移动，如待测样品中含有相应的抗体或抗原，则当样品液移至固定有抗原或抗体区时会发生特异性结合，在显色系统的作用下， 该区域出现一定的颜色。此法具有操作简单，不需任何仪器，20 min即能报告结果，适合

8、现场查病时使用。Dipstick试条上的固相用伤寒杆菌的IgM抗原包被，以胶体金作指示标记，检测血清中伤寒杆菌的IgM抗体。Tharwat :4等用伤寒Dipstick纸片法、培养法和肥达反应同时对30例经实验室诊断为伤寒的患者进行检测，结果浸染试验在特异性、敏感性、简单、快速方面优于常规方法。4聚合酶链反应（PCR）PCR是一种体外DNA扩增技术。其基本原理是酶促DNA合成反应，即在模板 DNA、引物和脱氧核糖核酸存在及DNA聚合酶的作用下，使DNA链扩增。由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成。随着微生物基因组学的发展，对伤寒杆菌的基因结构已经清楚，1989年Frankel : 5等发现伤

9、寒杆菌鞭毛蛋白存在着独立的超变基因区域，这个基因区域的核苷酸系列，能把伤寒杆菌与其他沙门氏菌区别开来。根据伤寒杆菌特异基因序列，设计引物，进行PCR检测，是现阶段检测伤寒杆菌的最快速准确的方法。4.1套式聚合酶链反应（Nested PCR） Nested PCR又称二次PCR。在这种技术中，首先用一对外引物进行第一轮PCR，然后再使用第一对引物扩增的 DNA序列内部的一对引物再次扩增。Kumar :6等根据伤寒杆菌鞭毛基因多变区核苷酸系列设计一对外引物：5 ACTGCDAAAACCACTACT 3 （位点：1072 1089 ）、5 TTAACGCAGTAAAGAGAG 3 （位点：1513

10、1530）进行第一轮 PCR, 扩增出其中的的特异性片段为 458bp。然后再使用第一对引物扩增的 DNA序列内部的一对引物：5 AGATGGTACTGGCGTTGCTC 3（位点：1092 1111）、5 TGGAGACTTCGGTCCCGTAG 3 （位点：1416 1435）再次扩增，扩增出其中的的特异性片段为343bp。他们对40例临床上疑似伤寒的患者， 采血进行Nested PCR检测及血液培养，同时，在相同条件下对20例非伤寒杆菌的血标本进行PCR检测和培养。结果血培养阳性的20例中，PCR亦全部阳性；血培养阴性的20例中，PCR呈阳性12例；非伤寒杆菌对照组 PCR及培养均呈阴性

11、。其特异性（100%）和敏感性（100%）明显高于传统（血、骨髓）培养法，并且敏感性不受预先抗菌治疗的影响，整个实验在10 h12 h内完成。由于使用了两对引物并且进行了两轮扩增反应，因此试验的敏感性和特异性均增强。在一定情况下，这种方法对减 少后扩增产物的污染 问题极为有用，但也增加了每次试验的复杂性。4.2 一次PCR只设计一对引物用于 PCR即完成检测。Massi :7等根据伤寒杆菌鞭毛蛋白基因序列，设计一对引物（5 ACTGCDAAAACCACTACT 3、5 TGGAGACTTCGGTCGCGTCGT3），扩增产物为 367bp 的碱基对。在这个实验中，他们对6株伤寒杆菌和8株非伤寒

12、杆菌同时进行 PCR扩增，结果只有6株伤寒杆菌出现367bp的特异性扩增区带，其他8株非伤寒杆菌均未出现367bp的扩增区带。他们对 73例疑似伤寒的患者采用PCR、血培养和肥达试验同时检测，结果阳性率分别为63% > 13.7%和35.6%。采用一次PCR比Nested PCR省时省力又降低成本。 但一次PCR检测临床血标本容易受到血中大量存在的外周单个核细胞DNA非特异性扩增的影响而使敏感性降低。4.3多重PCR多重PCR是在同一个反应管中同时完成多个不同基因扩增的PCR。由于伤寒杆菌有多种不同的抗原基因，只针对鞭毛抗原基因的单一 PCR，有时会漏检。多重 PCR能全方位高效率地检测

13、伤寒杆菌。Kumar 8 等针对伤寒杆菌的侵袭基因（invA ）、O抗原基因（prt）、H抗原基因（fliC d）和表面抗原基因 （ViaB ）设计不同的引物，在同一 PCR反应体系内同时扩增invA、viaB、fliC d and prt基因，以培养法为金标准，对25份水样和伤寒杆菌阳性对照进行检测，结果显示，25份水样均未检出伤寒杆菌，阳性对照最低检测量牛奶和水标本分别为 4.8 cfu/ml和2.0 cfu/ml，并且不出现假阳性和假阴性。与其他常规方法相比，多重PCR灵敏性更高，结果更准确、可靠。4.4免疫磁珠分离 PCR （IMS PCR） 免疫磁珠（immunomagnetic b

14、ead, IMB ）就是将直径 0.05 口"4 口具有超顺磁性的微粒表面 经化学修饰，使之与特异性抗体牢固结合，成为能与特异性抗原结合且有磁性的磁珠。被检测样品在磁板背景下与IMB混合，若有相应的抗原存在，IMB就会将其捕获，利用磁性将IMB聚集，然后进行分离，用于 PCR测定。Kumar :9等用伤寒杆菌抗鞭毛多克隆抗体包被环氧超顺磁珠，人工配制含伤寒杆菌不同浓度的食物和水标本，然后再采用IMB对标本中的伤寒杆菌进行 IMS，用于下一步的PCR检测。他们根据伤寒杆菌鞭毛蛋白基因序列，设计一对引物(5 TGGGCGACGATTTCTATGCC 3、5 TTTGCGGAACCTGGT

15、TGGCC 3)，预期的扩增产物为489bp。对5份肉类、5份牛奶、5份蔬菜、5份水样等标本进行IMSPCR检测，同时用常规 PCR平行检测。结果显示伤寒杆菌最低检出量分别为2X105 cfu/ml、15X105 cfu/ml、15X103 cfu/ml、2X103 cfu/ml，与常规PCR检测结果相符。这个试验中，检测伤寒杆菌的敏感性较差，特别是牛奶，可能与牛奶的脂质微粒和其他干扰因素多有关。IMS PCR技术最突出的优点是特异性强，可以明显提高准确性，仅用6h就能完成检测结果。4.5实时荧光定量PCR (Real time PCR) 常规PCR检测需要从反应体系中吸取产物作模板DNA进行

16、签定，转移过程中容易受外源DNA的污染，并随样品中待检 DNA 一起扩增，造成假阳性。最近发展起来的Real time PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，借助荧光信号检测扩增产物，利用荧光信号的累积来实时监测整个PCR的进程。Massi 10等针对从血标本分离出的伤寒杆菌鞭毛蛋白基因，设计引物和 TaqMan探针系列，对55份疑似伤寒患者的血标本进行检测。结果显示，其中8例培养阳性的血标本，每毫升血中伤寒杆菌的浓度范围为1.01 X103 cfu4.35 X04 cfu;在47例血培养阴性标本中，Real time PCR检测出40例阳性，每毫升血中伤寒杆菌的浓度范围为 3.9 X0

17、2 cfu9.9 X02 cfu拷贝。由于Real time PCR特异性高、敏感性好，克服了常规 PCR难以定量和重复性差的缺 点，自动化程度高，操作简便，具有广阔的应用前景。但需要昂贵的荧光检测仪和荧光分子探针，不利于基层实验室推广。检测伤寒杆菌的方法很多，各有其优缺点，随着现代分子生物学理论与技术的发展及新仪器研发，伤寒杆菌的检测方法将向早期、快速、准确、灵敏、特异等方向发展，特别是免疫、PCR等现代分子生物学技术的联用及Real time PCR的进一步完善，伤寒杆菌的检测方法将日臻成熟，为临床诊断提供更加快速准确的科学依据。【参考文献】1 Sadallah F, Brighouse

18、G . Production of specific monoclonal antibodies to Salmonella typhoid flagelin and possible application toimmunodiagnosis of typhoid fever J .J infec Dis,1990,161(1):5963.2 Cardona Castro N, Gotuzzo E， Rodriguez M, et al. Clinical Application of a Dot Blot Test for Diagnosis of Enteric Fever Due to

19、 Salmonella enterica Serovar Typhi in Patients with Typhoid Fever from Colombia and Peru J . Clin Diagn Lab Immunol,2000,7(2):312313.伤寒实验室诊断方法的评价作者：未知 文章来源：网络 点击数：2更新时间:2008-6-30 22:39:00作者：丁广祥，张小芳，祝莉，陈佳，李泉，罗军【关键词】伤寒；实验室诊断；评价摘要目的：选择准确、快速的检测方法对伤寒进行早期诊断。方法：对186例持续高热、疑似伤寒患者分别用肥达氏试验、乳胶凝集试验、伤寒杆菌抗原检测、对流免疫

20、电泳（CIEP）和血培养五种常用方法进行了检查。结果：五种方法的阳性率：肥达氏试验57.0%、乳胶凝集试验74.2%、伤寒杆菌抗原检测 80.1%、CIEP80.6%、血培养75.8%。结论：伤寒杆菌抗原检测阳性率较高、特异性和敏感性较 好，且操作简单、快速，适用于早期诊断；以两种或两种以上的方法联合应用可提高结果的准确性。关键词 伤寒；实验室诊断；评价伤寒是由伤寒杆菌引起的急性肠道传染病，目前仍是我国及世界上许多发展中国家较为常见的传染病之一，我们对目前临床实验室 常用的肥达氏试验、乳胶凝集试验、伤寒杆菌抗原检测、对流免疫电泳（CIEP）、血培养等五种伤寒实验室诊断方法进行了评价。1材料与方

21、法1.1 对象186例伤寒患者（根据伤寒、副伤寒诊断标准及处理原则GB160011995诊断），其中男性73例，女性113例。年龄7岁61岁，平均年龄39岁。47例正常对照组来源于 2005年2月至10月我院公务员体检合格者。1.2 肥达氏试验用标准抗原检测血清中各相应抗体的凝集效价（上海）。1.3乳胶凝集试验检测患者血清中抗体（四川）。1.4伤寒杆菌抗原检测ELISA法检测伤寒杆菌抗原（郑州）。1.5 CIEP检测患者血清中抗体（北京）。1.6 血培养培养基自制，肠杆菌科细菌生化编码鉴定管（GY/15e）（杭州）。严格按全国临床检验操作规程第二版操作。以上试验均严格按照试剂盒说明书操作，并在

22、试剂有效期内使用。2结果以血培养为金标准，分别与其他四种方法作了比较，以伤寒杆菌抗原检测、CIEP和血培养三种方法的灵敏度较高、特异性较好。五种检测方法的灵敏度、特异性、诊断效率、阴阳性预测值见表1。表1伤寒实验室诊断五种检测方法的评价指标方法（略）3讨论五种方法中，肥达氏试验（Widal）需1周以后才能检出抗体，此法虽仍是经典的临床诊治伤寒的重要实验室指标，但近年来发现，随着轻症和亚临床病例的增多，肥达氏试验的阳性率有下降趋势，难以满足临床的需要1。10%伤寒患者的肥达氏试验始终阴性或效价不高，可能与发病早期大量使用抗生素，抑制伤寒沙门菌，或应用肾上腺皮质激素等免疫抑制剂而抑制抗体的形成有关2。肥达氏试验早期阳性率低，需到第 3周、第4周才可达70%，实际上只有回顾性诊断价值，且假阳性较高3 。由于肥达氏试验使用历史长，人们比较熟悉，操作也较简便，所以临床上诊断伤寒常以肥达氏试验作为诊断依据。现在看来，这种做法