如何利用BLAST分析验证引物序列

1、如何利用BLAST分析验证引物序列引物设计完成之后，需要用软件进行分析，找到最佳的引物对，采用 Blast分析验证引物，可以知道序列的正确性，也能知道引物的特异性状况、引物的具体位置以及PCR产物的大小。 先找到需要设计引物的目标基也固有引物序列的mRNA序列，可以通过全文(如最先发现该基因的文章)，全文中有时可以找到大鼠 c-jun mRNA 序列的ACCESSION NUMBER ,在 PubMed 中的 “Nucleotide ” 中用此 ACCESSION NUMBER 就能找到序 列。 可以利用这个 ACCESSION NUMBER 在PubMed 中的“ Nucleotide ”中

2、搜索到序列 后，点击右边的"Links”,再点击里面的“Related Sequences ”就能找到所有的大鼠 c-jun mRNA 序列及其他物种的一些c-jun mRNA 序列。文献中的引物最好先验证其序列正确，并用软件分析引物比较好后再采用。通过 BLAST验证，既可知道序列是否正确，也可同时了解引物的特异性、引物的位置及PCR产物的大小等。 如果仅仅是为了验证引物序列是否正确(仅适合于基于完全匹配原则设计的引物)，也可 以用 Blast 的"Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn )”或“ Search for short, nea

3、rly"或"Search for short,exact matches ”搜索，具体方法为： 1.打开 Blast ,点击“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) nearly exact matches2 .等新页面完全显示后，将引物序列直接 copy到“Search ”框(没有必要将下游引物序 列转换成其互补链)，下面 3种方法都可以(我觉得 3种方法的搜索结果没什么区别，没 仔细比较过哦！)(1)直接拷贝上游引物序列，然后直接将下游引物序列拷贝在上游引物后面(2)直接拷贝上游引物序列，在上游引物序列后加一空格，然后直接将下游引物序列

4、拷贝在空格后面(3)直接拷贝上游引物序列，换行，然后直接拷贝下游引物序列注意：记住上、下游引物的长度，如上游引物为19bp、下游引物为18bp ,这在查看Blast结果时有用。3 .点击“BLAST!: 新页面完全出来以后，点击“ Format !”。4 .结果完全出来后，查找有没有和1-19、20-37同时完全匹配的基因，其他的就不用考虑了。当然，如果下游引物序列所对应的基因片段的3'端正好和上游引物序列的3'端的1或2个碱基互补，那就可能是19-37或18-37 。如果有，那你的引物序列就是正确的。从文献上查的引物，除了要用Blast验证其序列是否正确外，还是应该用软件分析

5、分析到底引物好不好。实例1、进入网页：http:/www.NCBI ./BLAST/2、点击 Search for short, nearly exact matchesNucleotide Quick? search fcn hhly similar sequences Qulddy search far dvergent sequences(difcontigjous negablast) Nudeotidenuc3tkfe BLASUfefestnartjivdMontjciuq me单bla4Translated Traiislated query roter d

6、t5base (blastx)3、在search栏中输入引物系列:注：文献报道 ABCG2的引物为 5 ' -CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3 'blast 程5 ' -TGCCCATCACAACATCATCT-3 '(1)输入方法可先输入上游引物，进行 blast程序，同样方法在进行下游引物的序。这种方法较繁琐，而且在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列，还要看与 游引物匹配的系列一一之后看两者的交叉。CT15AGATC 伫 TAGC C TTTGGTo匚 hn口s 中 dfltjhAar(2)简便的做法是同时输入上下游引物：有以下两种方法

7、。输入上下游引物系列都从5'3 oA、输入上游引物空格 输入下游引物B、输入上游引物回车输入下游引物4、 在 options for advanced blasting中：select from栏选择 Homo sapiensORGN , Expect后面的数字改为105、在 format 中：select from 栏选择 Homo sapiens【ORGN , Expect 后面的数字填上0 10。fFonnat部。吐 BGraphicd Overview /LmMulIZ %里加.RrtrievM BNCBhgj AlignmentCDSM型kinRCh即Mief Lower C

8、ase" M弟岫咳Cokr GrgySemkauto 76、点击网页中最下面的“ BLAST!7、AulofoTtnJit S?mi-£)uta Get the UKL with preset values ?出现新的网页，点击Format!Ycur request has sutctssfiiHy submitted and put int<> tht Blast QueutQueiy = (40 lerttrs)Ycur search w於 limited by an Entrei qutry; Homo sapiens ORGNTtie request I

9、D1166094202-1762S-88962626090 BLASTSrormatiThs results ue eclimated to be r»ady in 15 seconds but may be done soontr.8、等待若干秒之后，出现 results of BLAST 的网页。该网页用三种形式来显示blast的结果。(1)图形格式:Disciibtifion of 95 B】通北 Hhi 出口 th沙 Quk y l¥qiHiiurMoue-over to define and scores, dick lo show tlignmemts图中代表这

10、些序列与上游引物匹配、并与下游引物互补的得分值都位于4050分图中代表这些序列与上游引物匹配的得分值位于4050分，而与下游引物不互补图中代表这些序列与下游引物互补的得分值小于40分，而与上游引物不匹配通过点击相应的bar可以得到匹配情况的详细信息。HowATP-tinding cwsttt.Sequences producing Jlqinificanc alignnentj:2E2S0埼JCEINNan 口 54n?70i 址 iggg64g7.i百对11丁7，”3幻皿酒5叩？._11目2| 自23 LlZCjgh口,二 |Score (Bita)(2)结果信息概要:Homo a ftp

11、lens ATP-bihtling cassette.Hob» sapiens clone rLHlS5G81.DIL;.Homo sapiens clot# JAR Ele 5 1ECG2.- -42从左到右分别为：A、数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息B、系列的简单描述C、高比值片段对(high-scoring segment pairs, HSP)的字符得分。按照得分的高低由大到小排列。得分的计算公式=匹配的碱基x 2+0.1 。举例：如果有 20个碱基匹配，则其得分为40.1。D、E值：代表被比对的两个序列不相关的可能性。 The E value decreas

12、esexponentially as the Score (S) that is assigned to a match between two sequencesincreases。E值最低的最有意义，也就是说序列的相似性最大。设定的 E值是我们限定 的上限，E值太高的就不显示了E、最后一栏有的有 UEG的字样，其中：U代表：Unigene数据库E代表：GEO profiles 数据库G代表：Gene数据库结果详细信息： 圈出来的部分代表序列的信息 第一个大括号代表上游引物与该序列的正链【 Plus/Plus 的匹配情况:共有21个碱基匹配，得分 42.1分21 X2+0.1=42.1 ,

13、E值为0.020上游引物与序列的 21432163位点匹配第二个大括号代表下游引物与该序列的负链【 Plus/Minus 的匹配情况：共有20个碱基匹配，得分 40.1分20 X2+0.1=40.1 , E值为0.077。下游引物与该序列的 2936029379位点互补注意点：上游引物为20个碱基，为什么会变成 21个碱基呢？这是因为下游引物的第一个碱基为T,刚好与系列的2163位点的T匹配，因此下游引物的开头的第一个碱基被当成了上游引物了。同理，上游引物的最后一个碱基为G,被当成了下游引物了。通过寻找有没有与120位点、2040位点完全匹配的序列，就可以避免这个因素的干扰了。为什么与上下游引物匹配的ABCG2序列有多种A、为同一个基因来源的不同的mRNA片段B、 为该基因的DNA系列C、为同一个基因来源的不同的