人支气管上皮细胞在呼吸道合胞病毒感染后CFTR功能及上皮修复功能研究

1、人支气管上皮细胞在呼吸道合胞病毒感染后CFTR功能及上皮修复功能研究目的：呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV) 感染是临床取常见的,也是儿科最常遇到的呼吸道病原之一。支气管上皮细胞在RSV感染后，其病理改变取决于某些离子通道的功能活性及表达密度，其是否抑制了其囊性纤维 化跨膜转导调节因子(Cystic Fibrosis Transmembrane conductanceRegulator, CFTR)的表达水平和功能。我们拟建立RSV感染离体支气管上皮细胞模型,对RSV感染支气管上皮细胞后 CFTR的表达及功能进行研究。方法：1)建立RSV感染离体

2、培养支气管上皮细 胞模型将 原RSV病毒悬液(TCID50=10-3.82/0. 1ml)按1： 100000的浓度稀释，得RSV病毒感染人支气管上皮细胞模型的初始病毒浓度，以此浓度的RSV病毒感染人支气管上皮细胞制备离体RSV病毒感染人支气管上皮细胞模型。RT-PCF法验证模型中RSV存在以及其转录表达水平。2)人支气管上皮细胞感染RSV后CFTR的表达取对数生长期RSV感染人支气管上皮细胞模型中阴性对照组细胞、RSV感染后传代第1代的细胞和可稳定传代的模型组细胞，通过免疫荧光的 方法检测RSV!定感染后细胞CFTR勺蛋白水平定位及表达；Western-blot法检测RSV! 定感染后细胞C

3、FTR的蛋白表达；qRT-PCF法检测RSV!定感染后 细胞CFTR的rnRNA表 达水平。3)人支气管上皮细胞感染RSV后CFTR的功能变化取对数生长期RSV!定感染人支气管上皮细胞模型中阴性对照组细胞、RSV感染后传代第1代细胞和稳定传代 的模型组细胞，采用全细胞记录的方法记录RSV持续感染人支气管上皮细胞 模型阴性 对照组和模型组细胞上CFTRC1-的变化。加入激动剂5 的forskolin以后，激活 CAMP诱导CFTR Cl电流,细胞被钳制在-40mV,给予不同的电压刺激，电压自TOOmV逐步增到+100mV去极化电压时程为200nls步阶为20mV间隔为2S。去极化电压结束后恢复至

4、-40mV钳制电压。取各个电压状态下最大电流值 绘制I -V关系曲线。用MQA荧光染料法检测3组细胞的细胞内C1-浓度,制备标准品,检测标准 品C1- 浓度,绘制C”浓度标准曲线,根据d-浓度标准曲线,计算出待测3组支气管上皮细胞 中C1-浓度，同时RQA荧光染料法检测3组细胞的细胞内C”浓度荧光强度变化率。4) 人支气管上皮细胞感染RSV后上皮修复功能改变制备RSV感染人支气管上皮细胞的损 伤模型后，用显微视频分析BI-2000图像/免疫组化分析系统分别于机械损伤后 Ohrs, 8hrs, 12hrs, 18hrs, 24hrs测量缺损面积一次，收集 所有时间点的缺损区域图 像，勾画缺损区域

5、的边缘，以相关系数r来衡量两者是否存在直线相关关系，绘 制时间与修复面积的直线回归方程：Y=a+bX计算损伤修复指数(RL rep air in dex), RI值等于回归方程中b的绝对值(RI=| b )，以此反映不同处理组之间不同的修复速度，直线的斜率为损伤修复指数，斜率越大，损 伤修复速度越快。结果：1)RSV感染离体培养支气管上皮细胞模型的建立RT-PCR法验证模型中RSV存在以及其转录表达水平,发现在RSV感染后的RSV感染人支气管呼吸道 细胞模 型中，最初几代的RSV的表达水平是逐步增高的，然后维持在较稳定水平，但是从细 胞的形态学上来观察，并没有引起肉眼可见的细胞病变，同时也未被

6、人支气管上皮 细胞所清除。表示RSV稳定感染离体培养支气管上皮细胞模型建立成功。2)人支气管上皮细胞感染RSV后CFTR的表达的改变取对数生长期RSV稳定感染人支气管上皮细胞模型中阴性对照组细胞、RSV稳定感染后传代第1代细胞和稳定传代的模型组细胞,通过免疫荧光的方法检测RSV感染细胞CFTR勺蛋白水平定位及表达，并随机选取视野，计数荧光染色阳性细胞的百分率。结果显示 在RSV感染人支气管上皮细胞模型阴性对照组细胞的细胞膜及胞浆中可见较多的绿色染色的CFTR并且荧光染色阳性细胞的百分率较高；在RSV稳定感染模型传代第1代细胞就发现其细胞的细胞膜及胞浆中CFTF明显减少,并且荧光染色呈阳性细胞的

7、百分率明显减少；而在RSV稳定感染模型组细胞中细胞膜及胞浆中CFTR表达较阴性对照组细胞明显减少,较RSV感染模型第1代细胞也有略有减少，并且荧光染色阳性细胞的百分率也略有减少。推测RSV感染细胞后，可破坏气道上皮结构的完整性，致使局部气道微环境呈失稳态的状态，使得气道功能失调，改变了气道上皮应激应答机制，导致气道的功能和结构重塑，形成慢性气道炎症和气道病理改变。分别提取RSV感染人支气管上皮细胞模型阴性对照组细胞、RSV感染后传代第1代细胞和稳定的RSV感染模型组细胞的膜蛋白，Western-blot法检测RSV感染后细胞CFTR的蛋白表达,胶片曝光结果使用Quantity one灰度扫描软

8、件处理数据,其表达强度用CFTR灰度值/ P -actin灰度值表示,重复3次，统计结果,绘制直方图。实验结果显示，相对于阴性对照组细胞,RSV感染后第1代细胞和稳定RSV持续感染的模型组细胞CFTR表达明显降低，结果具有明显差异，*P<0.05. 分别提取RSV感染人支气管上皮细胞模型阴性对照组细胞、RSV感染后传代第 1代细胞和稳定RSV感染模型组细胞的RNA逆转录cDNA, RT-PCR法检测RSV感染后细胞CFTR的mRNAS达水平，结果mRNAfe达=2 (_ AAt )。结果显示,相对于阴性对 照组细胞,RSV感染后第1代细胞和稳定RSV感染模型组细胞CFTR的mRN

9、表达明显降低,结果具有明显差异，*P<0.05.3)人支气管上皮细胞感染RSV后CFTR的功能变化全细胞记录的方法记录RSV感染人支气管上皮细胞模型阴性对照组 和模 型组细胞上CFTR C”的变化。结果显示,在RSV感染的作用下,CFTRC1-电流密度增加，并具有浓度依赖性，在 10-3而为最大半数有效剂量。CFTRC1-阻断剂glibenclamide能阻断该电流,而非 CFTR Cl-阻断剂DIDS不能阻断该电流。MQA荧光染料法检测3组细胞的细胞内C1-荧光强度变化率,结果显示RSV持续感染后，细胞内C1-荧光强度变化率的变化相对于阴性对照组明显减少，表示RSV感染后，调节C1-通道的通道蛋白调节功能被抑制,C1-外流降低,细胞内C1-浓度变化率降低。4)人支气管上皮细胞感染RSV后上皮修复功能改变结果显示,RSV感染阴性对照组斜率绝对值较大，修复速度较快；RSV稳定感染模型组斜率绝 对值较小，修复速度较慢。提示RSV感染HBECs后,HBECs的自身增殖、迁移及损伤修复能力较RSV感染前，有所下降，其损伤修复功能发生重塑，