高效液相色谱-电喷雾串联质谱法(LC-ESI-MS MS)检测人血浆中罗红霉素浓度

1、Application Note: CM0026高效液相色谱-电喷雾串联质谱法(LC-ESI-MS/MS检测人血浆中罗红霉素浓度郭蓓宁 1 郁继诚1 张菁1 曹国英1 施耀国1 刘飞2(1 复旦大学华山医院抗生素研究所, 上海200040，2 赛默飞世尔科技应用实验室Key Words 罗红霉素 高效液相串联质谱法 血药浓度摘 要建立了人血浆中罗红霉素的高效液相色谱电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS检测方法。血浆样品经乙腈沉淀蛋白后，反相液相色谱分离净化后进行质谱分析, 采用选择反应监测模式(SRM进行检测，罗红霉素和内标物克拉霉素的检测离子对分别为m/z 837.5m/z 679.5和

2、m/z 748.5m/z 158.1。罗红霉素在101,000 ng/ml浓度范围内线性关系良好(r20.999，最低定量限(LLOQ为10 ng/ml 。在人血浆基质中，高、中、低浓度及LLOQ (800、400、30和10 ng/ml四个添加水平下，罗红霉素的平均提取回收率为96.7 %，日内及日间相对标准偏差分别为 4.5 和 8.2 。稳定性试验表明血浆样品室温下放置24h 或处理后放置12h 、80 放置3周及-80冻融3次对测定结果无影响。结果表明，该方法样品处理简单、灵敏、特异性高，为罗红霉素临床药代动力学等研究提供了简捷、准确的分析测定方法。关键词 罗红霉素，高效液相串联质谱法

3、，血药浓度Determination of roxithromycin in human plasma using liquid chromatography electrospray ionization tandam mass spectrometryGUO Bei-Ning, ZHANG Jing, YU Ji-Cheng, CAO Guo-Ying，SHI Yao-Guo(Institute of Antibiotics, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, ChinaAbstract To establish a

4、method for determination of roxithromycin in human plasma by LC-ESI-MS/MS. The plasma samples were applied to a C18 column interfaced with a triple quadrupole tandem mass spectrometer after pretreated with acetonitrile. Positive electrospray ionization was employed as the ionization source. The anal

5、yte and I.S. clarithromycin were detected by the use of selected reaction monitoring (SRM of the transitions m/z 837.5m/z 679.5 for roxithromycin and m/z 748.5m/z 158.1 for I.S, respectively. The method was linear in the concentration range of 10-1,000 ng/ml for plasma roxithromycin samples. The low

6、er limit of quantification (LLOQ was 10 ng/ml. The mean extraction recovery of roxithromycin was 96.7. The intra- and inter-day relative standard deviationfor roxithromycin plasma samples at LLOQ and three QC concentrations (30, 400 and 800 ng/ml across six validation runs was less than 4.5% and 8.2

7、%, respectively. A rapid and sensitive LC-MS/MS method was developed and validated for the determination of roxithromycin in human plasma. It can be applied to evaluate the pharmacokinetics of roxithromycin. Key words roxithromycin, LC-MS/MS, concentration1引言罗红霉素(Roxithromycin为14元环新的半合成大环内酯类抗生素，是红霉素

8、14元环9位酮基为O-(2-甲氧基 甲基肟所取代，其抗菌活性与红霉素相仿或略差，但血药浓度为大环内酯类抗生素中相对较高，在扁桃体、肺、前列腺及其他泌尿生殖道组织中的药物浓度可达有效治疗水平，临床主要用于敏感菌引起的呼吸道感染包括鼻窦炎、中耳炎、支气管炎及肺炎、皮肤软组织感染以及衣原体所致的泌尿生殖道感染。有关罗红霉素的血药浓度测定, 国外多采用高效液相电化学(HPLC-EC检测1-2，国内多采用微生物方法3-5和高效液相色谱紫外检测法(HPLC-UV 6，但由于罗红霉素原形药物和代谢物都有活性, 微生物法专属性不高；采用高效液相色谱紫外检测法, 由于罗红霉素在近紫外端210 nm 处有最大吸收

9、，内源性物质常有干扰，最低检测限仅为0.25 mg/L；也有作者7采用柱前衍生化后荧光检测的方法减少内源性物质干扰，但存在灵敏度低和操作繁琐的问题，相对来说LC-MS 方法8更有优势。本文建立的血浆中罗红霉素的高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS测定法，方法简单、灵敏，血样需要量及进样量少，分析时间短，实用性强，可用于临床药代动力学等研究。2 实验部分2.1 仪器、试剂和材料高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS仪由Waters Alliance 2690高效液相色谱仪（美国Wa t e r s 公司）和T S Q Quantum Discovery三级四极杆质谱仪（美国，Thermo

10、Fisher Scientific公司 组成，Xcalibur 2.0数据处理系统；Millipore 纯水系统(美国Millipore 公司）； METTLERAE240 分析天平(上海Mettler 公司 ；N-EVAPTM112氮吹仪(美国Organomation 公司 ；ABBOTT 离心机(德国Hettich 公司 ；-80 超低温冰箱(美国Thermo 公司 。药物浓度测试用对照品：罗红霉素，批号30351-200303，含量946 U/mg， 购自中国药品生物制品检定所；克拉霉素，批号33386-255-3，含量990 g/mg ，由Abbott 公司提供；乙腈（色谱纯），购自S

11、igma 公司；甲酸铵（分析纯），购自国药集团化学试剂有限公司；甲酸（分析纯），购自上海凌峰化学试剂有限公司；空白血浆取自健康受试者。2.2 LC-MS/MS条件氮气流下挥干，残渣用200 L流动相溶解，5 L进样分析。3 结果与讨论3.1 LC-MS/MS条件的选择克拉霉素是罗红霉素的结构类似物，较红霉素稳定性好，以克拉霉素为内标保证了方法的准确性和重现性；血浆样品直接用乙腈蛋白沉淀，方法简单，样品需要量少，适合大批量生物样品浓度的检测。在本试验的LC-MS/MS条件下, 罗红霉素和内标物克拉霉素的保留时间分别在1.49 min 和1.41 min, 峰形良好，分析时间仅为3 min。电喷雾

12、电离源正离子模式（ESI+），罗红霉素分子离子m/z 837.5产生的碎片离子中，以碎片离子m/z 679.5的信号最强且稳定，克拉霉素分子离子m/z 748.5 产生的信号较强且稳定的碎片离子为m/z 158.1，因此选择的选择反应监测（SRM ）离子对为罗红霉素m/z 837.5m/z 679.5，克拉霉素 m/z 748.5 m/z 158.1，见图1。3.2 方法学考察处理后，室温下分别放置0 h、3 h、6 h、9 h和12 h，以0 h为基准，放置12 h后罗红霉素回收率为90.9102.1 %；在80 低温冰箱中放置3周后，罗红霉素回收率为90.598.0 %；经80 冻融3次后

13、，罗红霉素回收率为93.8106.7 %。稳定性试验结果表明，该血浆样品室温下放置24h 或处理后放置12h 、80 放置3周及-80 冻融3次对罗红霉素的测定结果无影响。4 结 论本文建立的血浆中罗红霉素的高效液相色谱电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS检测法，简单、灵敏、实用性强，可用于药代动力学研究和特殊情况下的药物浓度监测。 References1. Birkett D J, Robson R A, Grgurinovich N, Tonkin A. Ther. Drug Monit., 1990, 12 (1: 6571.2. Denotes-Mainaird F M, Vinc

14、on G A, Jarry C H, Albin H C. J Chromatogr., 1989, 490 (1: 115123.3. Zhong Da-Fang (钟大放 , Huang Hai-Hua (黄海华 , Wang Ai-Min (王爱民 , Tian Lei (田蕾, Lei Xiao-Yan (雷晓燕,Zhang Ji-Wen (张继稳. Acta Pharmaceutica Sinica (药学学报, 1998, 33(8: 621625.4. Du Zhi-Min (杜智敏, Zhang Bo (张波, Zhao Hong-Guang (赵红光, Li Min (李 民

15、, Zheng Xin-Ming (郑心明. Journal of Harbin Medical University (哈尔滨医科大学学报, 2000, 34 (6: 438440.5. Huang Min-wen (黄敏文, Wang Guang-ji (王广基, Gao Ling (高凌, Qian Chen-Qin (钱陈钦, Wu Qi-Juan (吴起娟, Chen Xian-Wu (陈先武. Journal of China Pharmaceutical University (中国药科大学学报, 2004, 35 (4: 331333.6. Liu Hong-Ju (刘红菊, Wang Chun-Lin (王春霖, Ren Jin-Min (任进民, Wang Shu-Mei (王淑梅, Jiang Ye (蒋 晔. Journal of Hebei Medical University(河北医科大学学报, 2005, 26 (5: 353-354.7. Gwka FK, Karaniewicz-ada M. J Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 20