鼠抗人cKit单克隆抗体的制备及其特性鉴定

1、鼠抗人cKit单克隆抗体的制备及其特性鉴定 作者：刘虹辰, 毛朝明, 苏晓瑜, 阮铮, 丁秋兰, 王学锋, 王鸿利, 奚晓东【摘要】 目的: 鼠抗人cKit单克隆抗体（mAb）的研制及其生物学特性的鉴定。方法: 利用PCR技术获得人cKit的胞外免疫球蛋白区编码序列, 并将其亚克隆至原核表达载体pQE30, 构建出重组表达质粒pQE30hKitD45。测序鉴定正确后转化M15, 经IPTG37诱导4 h后, SDSPAGE显示融合蛋白（表达产物）以包涵体形式存在。用镍柱对融合蛋白进行纯化, 将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合, 经流式细胞术（FCM）分析和

2、多次克隆化培养, 筛选出特异分泌鼠抗人cKit分子mAb的杂交瘤细胞株。采用Western blot、 Ig亚型快速定性试纸法、 FCM等对mAb的生物学特性进行鉴定。结果: 成功表达及纯化了人cKit重组蛋白, 并获得1株持续、 稳定分泌鼠抗人cKit mAb的杂交瘤细胞株, 命名为SRJ1。ELISA和Western blot、 FCM结果显示了该株mAb 能够识别Kasumi白血病细胞株表面表达的天然的cKit分子, 并与人正常外周血细胞无交叉反应。值得注意的是, Kasumi细胞含有一个不被SRJ1识别的亚群, 虽然其表达cKit（Ab81 mAb的结合正常）。结论: 成功构建了原核表

3、达载体pQE30Kit45, 并获得高纯度的人pQE30Kit45重组蛋白; 成功制备了1株特异性的鼠抗人cKit mAb杂交瘤。其所分泌的抗体能特异地识别人cKit分子, 并且可能成为区分细胞表面表达不同cKit分子的潜在检测工具。 【关键词】 cKit; 原核重组蛋白; 杂交瘤; 单克隆抗体; 白血病 Abstract AIM: To prepare anticKit monoclonal antibodies and characterize their specificity of epitope recognition. METHODS: cDNA encoding human cK

4、it extracellular domain was constructed into a procaryotic expression vector pQE30 and the correctness of the reconstructed plasmid pQE30KitD45 was verified by sequencing. The plasmid was transformed into E.coli M15 strain. Recombinant 6His pQE30KitD45 was expressed after induction by IPTG for 4 h.

5、Then SDSPAGE results suggested that the products mainly formed inclusion bodies. The fusion protein was further purified with NiNTAHis affinity chromatography and then used to immunize BALB/c mice. The hybridomas were achieved by fusing the immunized spleen cells with the Sp2/0 myeloma cell line. Th

6、e positive clones were screened by FCM with CHOhKit cells. Hybidoma clones secreting anticKit antibodies were further subcloned and investigated for their biological activities by Western blot, rapid isotyping analysis and FCM. RESULTS: Recombinant human cKit fusion proteins were in vitro expressed

7、and purified to be used as immunogen. One stable hybridoma cell line, which continuously secrets specific anticKit monoclonal antibody (SRJ1) was established. The biological activity studies showed that the monoclonal antibody recognized the natural cKit expressed on the Kasumi leukemia cell line, b

8、ut failed to bind to the normal human peripheral blood cells. Interestingly, this monoclonal antibody failed to recognize a subpopulation of Kasumi cells that is reactive with the commercial anticKit mAb Ab81 suggesting that the cKit expressed by this subpopulation contains some sequencial and/or st

9、ructural aberrations that are distinguishable by mAb SRJ1. CONCLUSION: With an immunization procedure using purified recombinant human cKit fusion proteins. a hybridoma cell line continuously and stably secreting anticKit monoclonal antibody has been established. The monoclonal antibody SRJ1 specifi

10、cally recognizes human cKit expressed on the leukemia cells, and may provide a novel approach to analyze the possible structural variations of cKit expressed by different cells. KeywordscKit; procaryotic fusion proteins; hybridoma; monoclonal antibody; leukemia自cKit受体被发现以来, 其与干细胞因子（SCF）就作为一组重要的受体配基复

11、合物通过激活下游信号通路, 产生强大的连锁反应, 从而在细胞的分化增殖等调控中发挥着举足轻重的作用。迄今为止, 二聚化结构及十几条激酶介导的信号通路被陆续证实与cKit的持续活化密切相关。而针对这一异常活化设计的靶向药物也陆续投入应用, 这都成为目前人类相关肿瘤如急性髓性白血病（AML）、 胃肠道间质瘤（GIST）等研究的热点1-3。但世界范围内cKit相关抗体类药物的应用尚处于萌芽状态, 激酶抑制剂类药物的广泛应用却已经发现了许多不良反应。故本实验中我们通过工程菌表达并且纯化了cKit的部分蛋白片段, 将其免疫小鼠获得了特异性的单克隆抗体（mAb）, 为进一步探讨该蛋白的生物学功能提供了有利

12、的手段。 1 材料和方法 1.1 材料 IPTG、 dNTP、 Taq DNA聚合酶, ECL试剂购自上海生工公司, pGEMT载体及T4连接酶购自Promega公司, 限制性内切酶购自TaKaRa公司, 割胶回收试剂盒购自Axygen公司, DNA marker购自天根生物公司, F12、 RPMI1640、 次黄嘌呤胸腺嘧啶核苷（HT）和氨基喋呤次黄嘌呤胸腺核苷（HAT）均购自Gibco公司, 胎牛血清购自JRH公司, 聚乙二醇、 弗氏完全及不完全佐剂购自Sigma公司, 抗cKit mAb(Ab81)购自Santa Cruz Biotechnology, antihis mAb为本所保存

13、, 羊抗小鼠IgGHRP购自Calbiochem公司, NiNTA柱及纯化试剂盒购自Qiagen公司。原核表达载体pQE30、 感受态细菌E.coli DH5和E.coli M15由本室保存; hpGEMTKit由本所克隆并保存。小鼠骨髓瘤细胞（Sp2/0）、 仓鼠卵巢细胞（CHO）及稳定表达cKit的CHOhKit细胞株(用1 800 bp的cKit序列构建的真核表达载体转染的CHO细胞)为本室所建立并传代保存; 免疫用BALB/c小鼠来自本校医学院动物中心。 1.2 方法1 2 结果 2.1 pQE30hKitD45重组表达质粒的构建及鉴定 以hpGEMTKit质粒为模板, PCR扩增获得

14、hcKit胞外编码区产物cKitD45, 全长为686 bp, 与预期结果相符（图1）。直接将纯化的PCR产物与T载体连接, 菌落经蓝白斑初步鉴定后, 提取阳性克隆的质粒DNA, 分别用BamH I和Hind III酶切pQE30及pGEMTKitD45质粒, 将片段与双酶切后的pQE30载体相连。并再次酶切鉴定重组质粒pQE30hKitD45, 目的片段大小与预期相符（图2）。测序结果显示目的序列与NCBI（Accession Number : NM_000222）相应的序列相符, 证实表达载体构建成功。 2.2 pQE30hKitD45融合蛋白的诱导表达及Western blot鉴定 pQ

15、E30hKitD45阳性菌株经IPTG诱导后SDSPAGE显示: 在37、 1M IPTG诱导4 h的条件下, 融合蛋白的表达达到高峰, 蛋白条带位于696 bp处（与预期相符）。该重组蛋白主要以包涵体形式存在, 用NiNTA柱进行纯化后, 蛋白纯度扫描证实蛋白纯度在90%以上, Bradford法测定纯化后的hcKitD45蛋白浓度为300 mg/L（图3）。 2.3 mAb的制备与鉴定 3 讨论 cKit在配子形成、 造血、 肥大细胞发育及功能、 黑色素生成等方面均发挥着重要的作用。因此, c图6 饱和浓度mAb SRJ1对CHOhKit细胞及白血病细胞株Kasumi的FCM检测Kit表达

16、产物的完全缺失所致的功能丧失及碱基序列突变导致的功能性激活（包括点突变, 缺失突变, 错义突变, 插入突变等）与人类某些肿瘤（如AML、 GIST、 黑色素瘤等）的发生密切相关。近几年发现一系列致病相关性突变, 例: JMD区中FC522突变可引起受体自发磷酸化而激活, 从而导致非配基依赖性地信号传导的发生。而此类病例对于酪氨酸激酶抑制剂Imatinib的应用极为敏感4; NK822突变主要与AML/ETO所介导的白血病相关, 应用Imatinib可以有效抑制下游信号传递, 从而抑制恶性细胞的分裂增殖5; DV816突变主要发生于系统性全身肥大细胞增多症及肥大细胞性白血病, 其主要增强了表达c

17、kit受体细胞的迁徙能力, 并且在SCF含量丰富的组织中促进了肥大细胞的过度增生6。但也发现这种类型的突变能够造成Imatinib耐药病例的产生。针对Imatinib应用的局限性, 研究开发各种新型的激酶抑制剂亦成为另一热点。目前, PKC421、 AP23464、 Dasatinib等正尝试被应用于Imatinib耐药病例的。但是, 激酶类药物的应用本身就存在某些严重的副作用, 例如: 药物对于野生型cKit活性的抑制, 从而干扰正常细胞的分化增殖; 药物对其它结构或功能类似的激酶作用不同程度的抑制, 从而阻断重要的体内正常信号转导通路, 影响细胞正常功能; 另还有研究表明, 药物的应用大大

18、增加了诱发受体二次突变的机率。因此, 如何从根本上寻找到一种合理有效的抑制剂类药物对于cKit相关疾病的诊治将具有十分重要的意义。而最新的研究结果表明, cKit胞外免疫球蛋白第四、 五区的某些氨基酸残基, 例如: 精氨酸381, 谷氨酸386等, 对于二聚化过程中受体单体间的偶联起着关键性的作用7。这无疑为未来针对cKit受体相关肿瘤的治疗药物及方法的开发提供极为有效的新基点。 Kasumi是经典的t(8; 21)/M2细胞系。研究表明, Kasumi细胞表面所表达的cKit存在Asn822Lys位的突变, 且突变的cKit的数量约为正常cKit表达量的5倍。Asn822在RTK家族的激活环中高度保守, 能引起非配体依赖的cKit受体的激活, 使Kasumi细胞系成为体外研究具有cKit突变的AML的理想模型。 本研究中我们成功表达了重组人cKit, 制备了高特异性、 高效价的抗人cKit mAb, 同时表达的重组蛋白具有较高的纯度和较强的免疫原性; 同时, FCM针对白血病细胞株Kasumi的结果也提示其可能可以作为区