实验 献血员部分筛检试验

1、实验三 献血员部分筛检试验 n输血是临床最常见的治疗手段之一。输血是临床最常见的治疗手段之一。n输血传播性疾病有：输血传播性疾病有：n 病毒性肝炎（病毒性肝炎（HBV和和HCV）n 获得性免疫缺陷综合征获得性免疫缺陷综合征 （HIV）n 巨细胞病毒感染（巨细胞病毒感染（CMV ）n 梅毒感染梅毒感染n输血安全性是当前输血领域面临的重大的挑战输血安全性是当前输血领域面临的重大的挑战要求要求掌握血清丙氨酸氨基转移酶掌握血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定测定的原理和临床应用；的原理和临床应用；掌握两对半测定的实验原理和操作方法掌握两对半测定的实验原理和操作方法一、血清丙氨酸氨基转移酶一、血清丙氨酸氨

2、基转移酶（ALT)测定测定一、一、ALT测定原理测定原理ALT催化催化-酮戊二酸与丙氨酸之间的氨基转移反应：酮戊二酸与丙氨酸之间的氨基转移反应：L-丙氨酸丙氨酸+ -酮戊二酸酮戊二酸 L-谷氨酸谷氨酸+丙酮酸丙酮酸经一定时间反应后，加入经一定时间反应后，加入2,4二硝基苯肼终止反应，二硝基苯肼终止反应，并与溶液中的两种并与溶液中的两种-酮酸生成相应的酮酸生成相应的2,4二硝基苯腙，二硝基苯腙，在碱性条件下呈棕红色。但两种苯腙的吸收光谱有在碱性条件下呈棕红色。但两种苯腙的吸收光谱有差别，在差别，在500-520nm差异最大，以等摩尔浓度计算，差异最大，以等摩尔浓度计算，丙酮酸苯腙的吸光度约为丙酮

3、酸苯腙的吸光度约为-酮戊二酸苯腙的酮戊二酸苯腙的3倍。据倍。据此特点，可计算出丙酮酸的生成量，藉以推算出此特点，可计算出丙酮酸的生成量，藉以推算出ALT活力。活力。ALT二、操作方法n 空白管空白管 测定管（测定管（ml）n血清血清 0.10 0.10n谷丙基质液谷丙基质液 0.50n混匀混匀，37水浴水浴 30分钟分钟n2,4二硝基苯肼液二硝基苯肼液 0.50 0.50n混匀混匀，37水浴水浴 20分钟分钟n谷丙基质液谷丙基质液 0.50n0.4N氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液 5.00 5.00n混匀混匀，37水浴水浴 10分钟分钟n500nm，空白管调，空白管调0，由测定管吸光度，从标准曲线，

4、由测定管吸光度，从标准曲线查查ALT活力单位活力单位n注：共四份标本，每大组（注：共四份标本，每大组（4人）各做一个标本，整个实验室只人）各做一个标本，整个实验室只作一份对照作一份对照二、参考值二、参考值nALT40Un酶的活力受温度和孵浴时间及酶的活力受温度和孵浴时间及PH等等影响影响nALT是肝细胞损伤最敏感指标之一是肝细胞损伤最敏感指标之一也是判断急性肝炎是否恢复的很好也是判断急性肝炎是否恢复的很好指标指标二、两对半测定二、两对半测定一、原理一、原理nHBsAg：双抗体夹心法；单克隆抗双抗体夹心法；单克隆抗-HBs包被反应板，加入待侧标本，同时加包被反应板，加入待侧标本，同时加入多克隆抗

5、入多克隆抗-HBs-HRP，当标本中存在，当标本中存在HBsAg时，形成抗时，形成抗-HBs- HBsAg -抗抗-HBs-HRP 复合物，加入底物显色复合物，加入底物显色n抗抗-HBs：双抗原夹心法；纯化双抗原夹心法；纯化HBsAg包被，加入待侧标本，同时加入包被，加入待侧标本，同时加入HBsAg-HRP，当标本中存在抗，当标本中存在抗-HBs，形成，形成HBsAg-抗抗-HBs- HBsAg-HRP复复合物，加入底物显色合物，加入底物显色nHBeAg：双抗体夹心法；单克隆抗双抗体夹心法；单克隆抗-HBe包被，加入待侧标本，同时加入多克包被，加入待侧标本，同时加入多克隆抗隆抗-HBe-HRP

6、，当标本中存在，当标本中存在HBeAg，形成抗，形成抗-HBe- HBeAg -抗抗-HBe-HRP 复合物，加入底物显色复合物，加入底物显色n抗抗-HBe：中和抑制法；单克隆抗中和抑制法；单克隆抗-HBe包被，加入待侧标本，同时加入重组包被，加入待侧标本，同时加入重组HBeAg和多克隆抗和多克隆抗-HBe-HRP，形成竞争结合，如标本中抗，形成竞争结合，如标本中抗-HBe含量高，则含量高，则抗抗-HBe-HRP与与HBeAg结合后形成游离物被洗掉，显色淡结合后形成游离物被洗掉，显色淡n抗抗-HBc：竞争抑制法；重组竞争抑制法；重组HBcAg包被，加入待侧标本，同时加入抗包被，加入待侧标本，同

7、时加入抗-HBc-HRP，与抗原形成竞争结合，如标本中抗，与抗原形成竞争结合，如标本中抗-HBc含量高，则抗含量高，则抗-HBc-HRP与与HBcAg结合少，显色淡结合少，显色淡二、操作二、操作n加待测标本加待测标本0.05ml/孔孔n加酶结合物加酶结合物0.05ml/孔孔 混匀混匀，37水浴水浴 30分分钟钟n洗板：弃去反应板孔内液体，拍干，洗涤液注洗板：弃去反应板孔内液体，拍干，洗涤液注满反应孔，静置满反应孔，静置5-10秒，弃液拍干，反复秒，弃液拍干，反复5次，次，拍干拍干n加显色剂加显色剂:先先A 0.05ml/孔，再孔，再B 0.05ml/孔，孔，混混匀匀，37避光避光15分钟分钟n

8、终止：终止液终止：终止液0.05ml/孔孔 混匀混匀n450nm测定吸光度测定吸光度n注：注：4份标本，每大组（份标本，每大组（4人）各做一个标本同时检测，每份标人）各做一个标本同时检测，每份标本都要做本都要做(+)(-)对照，共五个试剂盒。试剂不要弄乱，以防出错对照，共五个试剂盒。试剂不要弄乱，以防出错三、注意事项n1.试剂使用前应摇匀，并弃去1-2滴后垂直滴加，注意用力均匀n2.加入试剂后要充分混匀n3.结果判断10分钟内完成n4.按传染病实验室检查规程操作临床意义nHBsAg 乙型肝炎表面抗原乙型肝炎表面抗原,存在于存在于HBV的外壳部分。血清中的外壳部分。血清中检出检出HBsAg是乙肝

9、的早期诊断指标之一是乙肝的早期诊断指标之一 ，出现于患者血清转氨酶，出现于患者血清转氨酶(ALT)升高前升高前28周，到恢复期周，到恢复期HBsAg滴度逐渐降低乃至消失滴度逐渐降低乃至消失 。仅为仅为HBV感染的标志，不反映病毒有无复制、复制程度、传染性感染的标志，不反映病毒有无复制、复制程度、传染性强弱及预后。强弱及预后。 n抗抗HBs 作为疫苗免疫机体产生的抗体作为疫苗免疫机体产生的抗体,对对HBV的感染具有保护的感染具有保护性免疫作用。乙肝疫苗接种者一旦出现除抗性免疫作用。乙肝疫苗接种者一旦出现除抗HBs以外的标志物以外的标志物,则则应视为既往感染。应视为既往感染。 nHBeAg 在血清

10、中的出现时间稍后于在血清中的出现时间稍后于HBsAg,一般血清一般血清阳性者阳性者,HBsAg亦为阳性。是亦为阳性。是HBV复复制活跃的血清学指标，有传染性。急性乙肝患者制活跃的血清学指标，有传染性。急性乙肝患者血清血清HBeAg持续阳性持续阳性3个月以上个月以上,则有疾病慢性化则有疾病慢性化倾向。倾向。n抗抗HBe 当血清当血清HBeAg转阴后转阴后,可出现抗可出现抗HBe,说说明病毒复制减少明病毒复制减少,传染性弱。抗传染性弱。抗HBe不是保护性不是保护性抗体。抗体。 nHBc 包括抗包括抗HBcIgM、IgA、IgG、和、和IgE等。抗等。抗HBc IgM是机是机体感染后最早在血液中出现的特异抗体体感染后最早在血液中出现的特异抗体,急性乙肝时呈高滴度。随急性乙肝时呈高滴度。随着急性乙肝的恢复着急性乙肝的恢复,抗抗HBc IgM滴度滴度(以及抗以及抗HBc IgA)降低乃至消降低乃至消失。如持续高滴度失。如持续高滴度,则有可能发展成慢性乙肝。研究发现则有可能发