硫辛酸对氧化低密度脂蛋白诱导的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响

1、 硫辛酸对氧化低密度脂蛋白诱导的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响高山1,程焱1,任晓莉1,田桂玲1,杨涛2【摘要】目的 探讨抗氧化剂硫辛酸(lipoic acid,LA对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL引起的大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC增殖的影响及其机制。方法 将培养的大鼠主动脉平滑肌细胞分成5组:对照组、ox-LDL组及LA三个浓度干预组(20、80和100 mg/L。MTT比色法测定VSMC增殖程度,生化法测定丙二醛(MDA及一氧化氮(NO含量。结果 与对照组相比,ox-LDL组大鼠主动脉VSMC增殖明显,MDA水平升高,NO水平降低,差异均有统计学意义(P<0.050.01

2、。与ox-LDL组比较,LA各浓度干预组(20、80和100 mg/L大鼠主动脉VSMC增殖受到抑制,MDA水平下降,NO水平升高,差异均有统计学意义(P均<0.05。LA各浓度干预组间VSMC增殖程度、MDA和NO水平差异亦有统计学意义(P<0.05。结论LA对ox-LDL引起的大鼠主动脉VSMC的增殖有抑制作用,而且可同时使细胞内MDA减少及NO含量增加,从而有可能延缓动脉粥样硬化的发生发展过程。【关键词】硫辛酸;抗氧化剂;胆固醇,LDL;肌,血管,平滑Effect of Lipoic Acid on Proliferation of Rat Aorta Smooth Musc

3、le Cells Induced by ox-LDL GAO Shan, CHENG Yan, REN Xiao-Li, et al. Department of Neurology, Tianjin Medical UniversityGeneral Hospital, Tianjin 300052, China【Abstract】Objective To investigate the influence and the mechanisms of antioxidant lipoic acid on the proliferation of rats aorta vascular smo

4、oth muscle cells (VSMC induced by ox-LDL.Methods The cultured rats aorta VSMC were divided into five groups, untreated control group,ox-LDL group and three groups with different dose of lipoic acid(20mg/L, 80mg/L and 100mg/L.Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT assay and biochemistry detection were used

5、 to determinethe effect of lipoic acid on anti-proliferation and the levels of malondialdehyde(MDA and nitricoxide(NO in the cultured rat aortic VSMC induced by ox-LDL.Results It was found that the proliferation of VSMC and the level of MDA in ox-LDL groupwere both higher than those in the control g

6、roup(P<0.01, P<0.05, and the level of NO was lowerthan that in the control group. Compared with ox-LDL group, three groups with different dose oflipoic acid had lower level of proliferation of VSMC and MDA and higher lever of NO(P<0.05. Furthermore, among the three groups with different dos

7、e of lipoic acid there were significantlydifferent in the level of proliferation of VSMC, the level of MDA and NO(P<0.05.Conclusion Lipoic acid can not only inhibit the proliferation of rat aortic VSMC induced by ox-LDL, but also lower the amount of MDA and enhance the amount of the NO in VSMC, t

8、hat may bethe mechanisms of delaying the development of atherosclerosis.【Key Words】 Lipoic acid; Antioxidants; Cholesterol, LDL; Muscle, vascular, smooth论著作者单位1300052 天津市天津医科大学总医院神经内科2大庆油田总医院神经康复中心通信作者程焱氧化低密度脂蛋白(ox-LDL在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS发生发展进程中起重要作用,能促进泡沫细胞形成及血管平滑肌细胞增殖1-3。从该角度探寻能够干预ox-LDL形成和V

9、SMC增殖等环节的药物,将对防治AS具有重要的意义。国外动物实验表明4-5,采用抗氧化剂硫辛酸(lipoic acid,LA喂养可阻止大鼠肾小动脉血管平滑肌细胞的增殖。LA还能对抗Cu2+和细胞对脂蛋白的氧化修饰作用6,从而减轻 ox-LDL致AS作用。应用抗氧化剂能抑制ox-LDL诱导VSMC增殖7-8。这些结果表明LA可能对AS具有一定作用。本研究从细胞水平观察LA对离体培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖、丙二醛(MDA及一氧化氮(NO含量等方面的影响,并探讨其可能的机制。1 材料与方法1.1 主要试剂与仪器 LA购自上海医药工业研究院(上海,中国,丙二醛(MDA及NO测定试剂盒购自南京聚力

10、生物医学工程公司(南京,中国。FBS(胎牛血清及DMEM-F12购自GIBCOL公司(Gaithersburg,MD,USA。低密度脂蛋白(LDL冻干粉、四甲基偶氮唑盐(MTT购自SIGMA公司(St Louis,MO, USA。余试剂为国产分析纯试剂。酶标仪(Bio-Rad,USA。CO2培养箱(NAPCO,日本。1.2 LDL氧化 LDL的体外氧化修饰采用Cu2+诱导法。将LDL冻干粉溶于0.0l mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS中,浓度为0.1 mg/L,然后加入终浓度为15mol/L的CuSO4,无菌条件下37温箱中反应24 h后加入终浓度为20mol/L的乙二胺四乙酸(E

11、DTA终止氧化。在4PBS中透析24 h以去除Cu2+,最后经过0.22m滤膜过滤除菌。氧化后的ox-LDL 用TBARS法测定其蛋白质含量。本实验中ox-LDL浓度定为80 mg/L9。1.3 VSMC培养传代与鉴定 雄性SD大鼠20只(SPF级,230250 g,购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心,将大鼠腹腔注射水合氯醛(0.3 mg/kg麻醉引颈处死后,在无菌条件下分离胸主动脉,放入高压灭菌的D-Hanks液中清洗,剥离血管中膜,洗净后剪碎,以0.25%胰酶消化,收集细胞于细胞培养瓶中。加入含20%小牛血清的DMEM-F12培养液,放入37、5%CO2培养箱中培养,48 h后换

12、液,继续培养57 d,待细胞在瓶底生长融合呈“峰与谷”状后,用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶液消化传代;第37代的细胞用于实验。1.4 细胞分组 将细胞按1×105个/ml接种于24孔板中,37、5%CO2培养箱中培养过夜,倾去培养基,进行分组实验。分别接种于96孔板中,每组6孔。(1空白对照组:细胞正常培养48 h,不加任何药物;(2ox-LDL组:细胞中加入80 mg/L ox-LDL后,培养48 h;(3ox-LDL+LA(20组:细胞与20 mg/L LA预孵2 h,再加入80 mg/L ox-LDL培养48 h;(4ox-LDL+LA(80组:细胞与80 mg/L

13、 LA预孵2 h,再加入80 mg/L ox-LDL培养48 h;(5ox-LDL+LA(100组:细胞与100 mg/L LA预孵2 h,再加入80 mg/L ox-LDL培养48 h。1.5 VSMC增殖程度测定 采用细胞增殖抑制实验(MTT比色法,将分组培养的细胞每孔加入5 g/L MTT 15l继续孵育4 h,弃去上清液后每孔加入二甲亚砜150l终止反应,振荡10 min以充分溶解颗粒,于酶标仪490 nm波长处读取其吸光度值(A。1.6 生化指标的测定 分组培养板中的细胞经冻融处理(倒去细胞培养液,加入适量的D-Han ks液洗2遍,用0.125%胰酶消化细胞,加适量D-Hanks液

14、充分悬浮,1000 r离心10 min,去上清。加1 ml D-Hanks液稀释吹打均匀,液氮中浸泡5 min,取出后室温静置约20 min,共3次,然后经12 000 r,4离心10 min,取上清液用硝酸还原酶法检测NO含量,同时按试剂盒所示操作流程得出上清液中MDA的含量。1.7 统计分析 数据以±s表示,以SPSS 13.0软件进行统计分析。组间差异采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1大鼠主动脉VSMC鉴定大鼠主动脉 VSMC融合后在摄影显微镜下(Olympus,日本可见VSMC呈极性生长,可重叠生长达多层,典型“峰”、“谷”状排列(图1。

15、2.2 LA对ox-LDL诱导大鼠VSMC增殖的影响 与对照组比较,ox-LDL组VSMC增殖明显(P<0.01;与ox-LDL组比较,LA各浓度干预组(20、80和100 mg/LVSMC增殖受到抑制(P<0.05;LA各浓度干预组间VSMC增殖程度差异有统计学意义(P<0.05(图2。2.3 LA对ox-LDL诱导大鼠VSMC内MDA水平的影响 与对照组比较,ox-LDL组MDA值明显升高(P<0.05;与ox-LDL组比较,LA各浓度干预组(20、80和100 mg/LMDA值明显降低(P<0.05;LA各浓度干预组间MDA水平差异有统计学意义(P<0

16、.05(图3。2.4 LA对ox-LDL诱导大鼠VSMC内NO水平的影响 与对照组比较,ox-LDL组NO值明显降低(P<0.05;与ox-LDL组比较,LA各浓度干预组(20、80和100 mg/LNO值明显升高(P<0.05;LA各浓度干预组间MDA水平差异有统计学意义(P<0.05(图4。3 讨论本实验证实了抗氧化剂LA有抑制ox-LDL 诱导的离体培养大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的作用,得出了细胞学方面的直接证据。提示LA 可能会阻止血管中膜平滑肌增厚,这对防治AS 进展和支架术后再狭窄的治疗有重要意义。LA是高效抗氧化剂,可清除活性氧自由基、再生谷胱甘肽,形成抗氧化剂的

17、再生循环网络10;LA被细胞吸收后转化为抗氧化能力更强的二氢硫辛酸(DHLA,能够激活细胞内其他抗氧化剂;LA还可以增强维生素C及维生素E的效力,能对抗线粒体利用氧时所产生的自由基,产生抗氧化协同效果;同时它具有脂溶与水溶的双重特性,可在细胞的“水相”及“脂相”等部位清除自由基,发挥“全能抗氧化剂”的作用11,有效地保护机体,增强机体的抗图1 平滑肌细胞呈梭形或长梭形,高低起伏呈“峰与谷”状( ×200图2 LA对ox-LDL诱导大鼠VSMC增殖的影响 与对照组比较, *P<0.05;与ox-LDL组比较,#P<0.05;与ox-LDL+LA(20组比较,P<0.0

18、5;与ox-LDL+LA(80组比较,P<0.05图3 LA对ox-LDL诱导大鼠VSMC内MDA水平的影响 与对照组比较, *P<0.05;与ox-LDL组比较,#P<0.05;与ox-LDL+LA(20组比较,P<0.05;与ox-LDL+LA(80组比较,P<0.05图4 LA对ox-LDL诱导大鼠VSMC内NO水平的影响 与对照组比较, *P<0.05;与ox-LDL组比较,#P<0.05;与ox-LDL+LA(20组比较,P<0.05;与ox-LDL+LA(80组比较,P <0.052.01.81.61.41.21.00.80.6

19、0.40.2对照组ox-LDL组ox-LDL+LA(20A值ox-LDL+LA(80ox-LDL+LA(100*#1412810642MDA(mmol/L对照组ox-LDL组ox-LDL+LA(20ox-LDL+LA(80ox-LDL+LA(100*#7645321NO(mmol/L对照组ox-LDL组ox-LDL+LA(20ox-LDL+LA(80ox-LDL+LA(100*# 氧化能力。LA正逐渐用于与氧化应激有关疾病(如高血压、糖尿病等的治疗中12,在抗氧化领域具有良好的应用前景。目前普遍认为ox-LDL是致AS的重要因素。已证实在动物及人类动脉硬化斑块中存在ox-LDL13。ox-LD

20、L一方面与巨噬细胞清道夫受体结合,吞噬脂质而形成AS的早期病变-泡沫细胞14,另一方面还能通过促进细胞因子分泌15、细胞募集、细胞表型改变、内膜重建、血管壁平滑肌细胞增殖等效应发挥致AS 作用16。研究表明ox-LDL还可能通过ROS和Cer/NAD(PH/MAPK途径介导VSMC的增殖17-18。推测LA可能是通过抑制各种以过氧化负离子为中介的效应和过氧化源NAD(P H氧化酶的活性,以及从NAD(PH氧化酶和ROS等环节来抑制ox-LDL诱导SMC增殖。ox-LDL在较高浓度时(100 mg/L以上时将干扰VSMC生长,表现为分裂指数下降,细胞转型少,VSMC凋亡和凋亡小体增加,甚至细胞死

21、亡19。而本实验中ox-LDL浓度为80mg/L 呈现出显著的促VSMC增殖作用,与文献结果相一致9。NO是由底物左旋精氨酸(L-arginine, L-Arg在NO合酶(NOS作用下合成的可介导很多生理效应的特征性信号分子,对VSMC 增殖、基质沉着、血小板聚集和白细胞黏附方面起重要作用20。本实验证实LA可升高平滑肌细胞内NO含量,从而缓解ox-LDL对VSMC 中L-精氨酸-一氧化氮系统的抑制效应,与国内相关研究结论相一致21。相关的研究还发现LA恢复大鼠胸主动脉中NO的基础量与其对超氧阴离子和过氧化氢自由基的清除有关22。这可能是LA抑制VSMC增殖的机制之一。MDA作为氧自由基与生物

22、膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物,其含量变化间接反应了组织中氧自由基含量及细胞损伤程度。本实验观察到LA可使培养的VSMC中的MDA含量显著降低,这提示LA可能通过增强氧自由基清除剂的活性减弱氧自由基、脂质过氧化反应的损害,从而抑制VSMC的增殖。本研究结果表明LA具有抑制ox-LDL诱导的VSMC增殖作用,该效应与LA浓度有关,提示LA可能具有防止AS的发生发展,缓解AS 病程的作用,有治疗AS相关疾病的临床应用前景。有关LA抑制VSMC增殖的全面确切的机制,还有待于今后继续深入地研究。志谢:天津市环湖医院细胞生物研究室张文治教授、苏心研究员为实验工作提供了大力指导和帮助,在此表示

23、感谢。参考文献1 Ross R, Glomset JA. Atherosclerosis and arterysmooth muscle cell: Proliferation of smooth muscle is a key event in the genesis of the lesions of atherosclerosisJ. Science, 1973, 180:1332-1339.2 Wu YJ, Hong CY, Lin SJ, et al. Increase of vitaminE content in LDL and reduction of atheroscleros

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