硫酸镍致大鼠睾丸细胞线粒体及微粒体损伤

1、硫酸镍致大鼠睾丸细胞线粒体及微粒体损伤                 【关键词】 硫酸镍；睾丸；线粒体；微粒体；氧化应激摘要： 目的 从氧化应激角度探讨硫酸镍(NiSO4)对大鼠睾丸细胞线粒体及微粒体的毒性作用。方法 健康性成熟Wistar雄性大鼠32只，随机分为4组：生理盐水(NS)组，硫酸镍(NiSO4)125，250，500mg/kg组，等容积腹腔注射染毒，1次/d，连续30d。制备睾丸组织匀浆，离心提取线粒体和微粒体，采用分光

2、光度法检测睾丸细胞线粒体及微粒体中脂质过氧化物(LPO)、总抗氧化能力(TAOC)、活性氧(ROS)水平的变化。结果 染毒组与对照组比较，大鼠睾丸脏器系数无明显变化(P005)。镍可引起睾丸组织中LPO、ROS含量升高，与对照组比较差异有统计学意义(P005)；各染毒组TTOC均低于对照组(P<005)。结论 镍对大鼠睾丸细胞的损伤可能与其所致的睾丸细胞线粒体及微粒体氧化应激效应增强有关。关键词： 硫酸镍；睾丸；线粒体；微粒体；氧化应激Oxidative damage of mitochondria and micriosome in testis cells induced by ni

3、ckel sulfate in rats Abstract： Objective To explore the mitochondria and microsome of testis cells caused by nickel sulfate in rate.Methods Thirtytwo male Wistar rats with sexual maturation were pided into four groups randomly,and three groups of rats were administrated intraperitoneally with nickel

4、 sulfate daily at doses 125,250，500 mg/kg respectively for 30 days,but the control group was administrated with saline in same volume according to the rats'weight.The mitochondria and microsome of testis cells were prepared by centrifugation technique to detect the levels of lipid peroxidation (

5、LPO),total antioxide capacity (T-AOC),reactive oxygen species (ROS) in spectrophotometry.Results The organ coefficient of testis exposed to NiSO4 had no change compared wth the control group(P005).The LPO and ROS contents in testis of exposure groups were higher than that of control group(P005),but

6、the T-AOC levels of the exposure groups were decreased compared with the control group(P001).Conclusion The rat's testis damage is related to the enhancement of oxidative stress of mitochondria and microsome caused by nickel sulfate.Key words： nickel sulfate;testis;mitochondria;microc 本文硫酸镍致大鼠睾丸

7、细胞线粒体及微粒体损伤- ome;oxidative stress镍是机体生命活动所必需的微量元素，其生物学作用极为广泛，但其化合物又是当前主要的职业危害因素和环境污染物之一。过量镍的摄入可造成机体多系统、多器官损伤，同时也是一种比较明确的致癌剂2，3。动物实验发现，大剂量的镍及其化合物对雄性实验动物生殖功能具有毒性损害作用，镍可透过血-睾屏障，蓄积在睾丸组织中4，引起睾丸生精代谢障碍，精子生成减少，形态发生改变，畸形率升高5，并可引起雄性大鼠性激素水平的改变6。研究发现，镍可致大鼠血清、肌肉、肝脏和肾脏中脂质过氧化物(LPO)含量升高，并引起抗氧化酶活性的改变7，8。因此，本文从线粒体和微粒

8、体的氧化损伤角度探索镍对睾丸生殖细胞损伤的机制，为镍致雄性生殖毒性的防治提供理论依据。1 材料与方法11 实验动物 健康Wistar雄性大鼠，体重180220 g(兰州大学实验动物中心)。12 试剂和仪器 硫酸镍(NiSO4)，分析纯(西安化学试剂厂)。脂质过氧化物(LPO)、总抗氧化能力(TAOC)、活性氧(ROS)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。Dptima XL100K型高速冷冻离心机(美国Meckman公司)。722型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。SHAB型水浴恒温振荡器(常州国华仪器厂)。13 方法131 剂量选择与分组 健康Wistar雄性大鼠32只，随机分为4组：

9、对照组(NS)，硫酸镍125，250，50mg/kg组。连续腹腔注射染毒30d，1次/d，自由摄食饮水。132 样品制备 (1)组织匀浆的制备：染毒结束次日，颈椎脱位法处死大鼠，迅速摘取双侧睾丸，称重后取双侧睾丸，去包膜，放入表面皿中剪碎，加入匀浆介质(001mol/L Tris-HCl缓冲液，pH74)，用玻璃匀浆器制成10%(w/v)的睾丸组织匀浆。(2)线粒体的制备：取10%的组织匀浆，用低温冷冻离心机1 500r/min离心10min，弃沉淀，上清液再重复离心1次，弃沉淀，留取上清液用低温高速冷冻离心机12000r/min离心15min，沉淀物即为线粒体。(3)微粒体的制备：取分离线粒

10、体后的上清液，用高速冷冻离心机40000r/min离心30min，沉淀物即为微粒体。将分离提取的线粒体和微粒体分别用冰冷的匀浆介质制备成混悬液，超声破膜后待用。133 指标检测 每个样品检测2个平行样，严格按照试剂盒说明书测定睾丸细胞线粒体和微粒体中LPO、TAOC、ROS的水平。14 统计分析 采用SPSS 100软件进行单因素方差分析，并进行两两比较。2 结果21 染毒动物的一般状况和睾丸脏器系数的变化(表1) 染毒早期动物出现轻微的兴奋表现，染毒中期有精神萎靡，行动迟缓，毛发蓬松，拖尾等现象，染毒后期个别动物出现腹泻症状，至染毒结束时未发现动物死亡情况。睾丸大体形态观察发现，硫酸镍25

11、mg/kg组大鼠睾丸组织出现充血、水肿等现象，脏器系数略大于其他各组(P005)。50 mg/kg组睾丸脏器系数降低，与NS组比较，差异无统计学意义(P005)。表1 NiSO4对大鼠睾丸细胞线粒体中LPO、TAOC、ROS的影响（略）注：与对照组比较，a P ) 005，b P001；n=8由表1可见，与对照组比较，染毒组大鼠睾丸细胞线粒体中T-AOC降低(P001)，LPO和ROS含量升高(P005)。22 NiSO4对大鼠睾丸细胞微粒体中LPO、T-AOC、ROS的影响(表2)表2 NiSO4对大鼠睾丸细胞微粒体中LPO、T-AOC、ROS的影响（略）注：与对照组比较,a P005，b

12、P001;n=8由表2可见，染毒组大鼠睾丸细胞微粒体中T-AOC降低(P<0.01)，LPO和ROS含量升高(P<0.05)。3 讨论本实验结果表明，硫酸镍腹腔注射染毒后，大鼠睾丸细胞线粒体的氧化应激效应增强，提示此时线粒体产生过量ROS，引发链式脂质过氧化生成大量的LPO，同时抑制T-AOC活性，引起线粒体内膜跨膜电位的下降，导致线粒体膜通透性发生变化，甚至出现线粒体DNA的广泛损伤9，进一步引起睾丸生殖细胞的损伤。本文结果显示，镍可导致微粒体氧化应激效应增强，引起微粒体膜的损伤及其氧化酶类活性的变化，造成睾丸细胞的损伤。研究发现，镍可导致大鼠睾丸组织匀浆中ROS、LPO和T-A

13、OC水平的改变。Kodipura等报道，镍可导致小鼠睾丸组织细胞匀浆、线粒体和微粒体中LPO含量升高，抑制谷胱苷肽过氧化物酶和S-转移酶活性，使乳酸脱氢酶活性升高，与本次实验结果一致。因此，本实验结果提示，线粒体和微粒体氧化应激水平的增强可能是镍致睾丸细胞损伤的机制之一。参考文献1 刚葆琪，庄志雄.我国镍毒理学研究进展J.卫生毒理杂志，2000,14(3):129-135.2 Denkhaus E,Salinikow K.Nickel essentiality,toxicity,and carcinogenicityJ.Critical Reviews in Oncology Hematolo

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