第2章-色谱基本理论a-塔板理论

1、2-1 2-1 概述概述 色谱法早在色谱法早在19031903年由俄国植物学家年由俄国植物学家M.TswettM.Tswett（茨维特）提（茨维特）提出，成为十分重要的分离分析手段。出，成为十分重要的分离分析手段。实验：叶绿素分离：石油醚浸提叶片实验：叶绿素分离：石油醚浸提叶片碳酸钙填充拄碳酸钙填充拄纯纯净石油醚淋洗净石油醚淋洗叶绿素分离（叶绿素分离（a a，b b，叶黄素，胡萝卜素），叶黄素，胡萝卜素）色谱法共同的基本特点是具备两个相：色谱法共同的基本特点是具备两个相：不动的一相，称为固不动的一相，称为固定相；另一相是携带样品流过固定相的流动体，称为流动相定相；另一相是携带样品流过固定相的流

2、动体，称为流动相。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相组分在固定相滞留滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出（固定相中流出（洗脱洗脱）。）。n 气体为流动相的色谱称为气相色谱（气体为流动相的色谱称为气相色谱（GCGC），根据固定相是固），根据固定相是固体吸附剂还

3、是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（液体），又可分为气固色谱（GSCGSC）和气液色谱（）和气液色谱（GLCGLC）n液体为流动相的色谱称液相色谱（液体为流动相的色谱称液相色谱（LCLC）。同理，液相色谱亦可）。同理，液相色谱亦可分为液固色谱（分为液固色谱（LSCLSC）和液液色谱）和液液色谱LLCLLC）n超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱（超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱（SFCSFC）。）。n通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相通过化学反应将固定液键合到载体表面，这

4、种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（的色谱又称化学键合相色谱（CBPCCBPC）。）。 利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为离的方法，称为吸附色谱吸附色谱法法。利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为称为分配色谱法分配色谱法。利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为分离的方法，称为离子交换色谱法离子交换色谱法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗

5、透而达到分离的利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为方法，称为凝胶色谱法凝胶色谱法或或排阻色谱法排阻色谱法。利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为分离的技术称为亲和色谱法亲和色谱法，常用于蛋白质的分离。，常用于蛋白质的分离。 。2-12-2 2-2 色谱流出曲线及有关术语色谱流出曲线及有关术语2-1基线基线(Baseline) 、基线噪声基线噪声(Baseline noise)基线漂移基线漂移(Baseline drift)死时间死时间(Dead time)、死体积、死体积(Dead

6、volume)保留值保留值(Retention value): Retention time & Retention volume调整保留值调整保留值(Adjusted retention value)：Adjusted retention time & Adjusted retention volume相对保留值相对保留值(Relative retention value)区域宽度区域宽度(Peak width) 标准偏差标准偏差(Standard deviation) 半峰宽度半峰宽度(Peak width at half-height) 峰底宽度峰底宽度(Peak width at pe

7、ak base) 峰高峰高（Peak height）l 柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，即图2-1中Ot线理想的基线应该是一条水平直线。基线噪声，基线漂移2-1 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，如图2-1中BA 1 1死时间死时间t tM M 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，如图2-1中 OA。 因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相近测定流动相平均线速时，可用柱长L与tM的比值计算。2 2保留时间保留时间t tR R 试样从进样开始到柱后出现峰极大试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的

8、时间，称为保留时间，如点时所经历的时间，称为保留时间，如图图2-1 OB2-1 OB它相应于样品到达柱末端它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间的检测器所需的时间 图图2-1 色谱流出曲线色谱流出曲线 由于组份在色谱柱中的保留时间由于组份在色谱柱中的保留时间t tR R包含了组份包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以滞留所需的时间，所以t tR R实际上是组份在固定相实际上是组份在固定相中停留的总时间保留时间可用时间单位（如中停留的总时间保留时间可用时间单位（如s s）或距离单位（如或距离单位（如cmcm）表示。）表

9、示。 保留时间是色谱法定性的基本依据保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一，但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响，因此组份的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定定 V VM M 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和当头间的空间以及检测器的空间的总和当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速死时间与流动相体积流速F F0 0（

10、L Lminmin）计）计算：算： V VM M = t = tM MF F0 0 6 6调整保留体积调整保留体积V VR R 某组份的保留体积扣除死体积后，称某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积，即该组份的调整保留体积，即 VR = VR- VM7相对保留值2.1 某组份某组份2 2的调整保留值与组份的调整保留值与组份1 1的调整保的调整保留值之比，称为相对保留值：留值之比，称为相对保留值： 由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据 必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时

11、间或保留体积之比 . 式中式中t tR2R2为为后出峰后出峰的调整保留时间，所以的调整保留时间，所以这时这时总是大于总是大于1 1的的 。12RRtt1. 标准偏差 即0607倍峰高处色谱峰宽的一半，如图2-1中EF距离的一半。2. 半峰宽Y1/2 即峰高一半处对应的峰宽，如图2-1中GH间的距离它与标准偏差的关系是： Y1/2 = 2.3542-13. 3. 基线宽度基线宽度W W 即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，如图2-1中IJ的距离它与标准偏差的关系是： Y = 4 2 23 3 色谱法分析的基本原理色谱法分析的基本原理 目的：将样品中各组分彼此分离，组分要达到完目的：将样品中各

12、组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远全分离，两峰间的距离必须足够远. . 两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的的，即与色谱过程的热力学性质热力学性质有关。有关。但是两峰但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的程的动力学动力学性质有关。性质有关。因此，要从热力学和动力因此，要从热力学和动力学

13、两方面来研究色谱行为。学两方面来研究色谱行为。 1分配系数分配系数K K 色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配或吸附反复多次地分配或吸附-脱附过程。脱附过程。分配系数是描述分离过程中样品分子在两相间分配分配系数是描述分离过程中样品分子在两相间分配的参数，的参数，它是指在一定温度和压力下，组分在固它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值 分配比又称容量因子，它是指在一定温分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡度和压力下，组分在两

14、相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。时，分配在固定相和流动相中的质量比。即即 msMM量组分在流动相中物质的量组分在固定相中物质的 式中式中C CS S，CmCm分别为组分在固定相和流动相的浓度；分别为组分在固定相和流动相的浓度； VmVm为柱中流动相的体积，近似等于死体积。为柱中流动相的体积，近似等于死体积。VsVs为柱中为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，含义。例如：在分配色谱中，VsVs表示固定液的体积；表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。在尺寸排阻色谱中，则表示固

15、定相的孔体积。 滞留因子滞留因子( (保留比保留比)Rs)Rs设流动相在柱内的线速度为设流动相在柱内的线速度为u u，组分在，组分在柱内线速度为柱内线速度为u us s，由于固定相对组，由于固定相对组分有保留作用，所以分有保留作用，所以u us su u此两速此两速度之比称为滞留因子度之比称为滞留因子RsRs。 对组分和流动相通过长度为对组分和流动相通过长度为L L的的色谱柱，其所需时间分别为色谱柱，其所需时间分别为通过色谱流出曲线通过色谱流出曲线, ,就可以求得分配比就可以求得分配比k.k. 其中其中称为称为相比率相比率，它是反映各种色谱柱，它是反映各种色谱柱型特点的又一个参数。例如，对填充

16、柱，其型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其值一般为值一般为6 63535；对毛细管柱，其；对毛细管柱，其值为值为6060600600。 l分配系数是组分在两相中的浓度比分配系数是组分在两相中的浓度比, ,分配比是分配比是组分在两相中分配总量之比组分在两相中分配总量之比. .热力学性质热力学性质( (拄拄温温, ,柱压柱压) )l分配系数只取决与组分和两相性质分配系数只取决与组分和两相性质, ,与两相体与两相体积无关积无关, ,而分配比不仅取决与组分和两相性质而分配比不仅取决与组分和两相性质, ,还与相比有关还与相比有关. .l一定的色谱体系中一定的色谱体系中, ,组分分离决定于组分在每组分分

17、离决定于组分在每相中的相对量相中的相对量, ,而不是相对浓度而不是相对浓度, ,因此因此, ,分配比分配比是衡量色谱柱对组分保留能力的重要参数是衡量色谱柱对组分保留能力的重要参数.k.k越大越大, ,保留时间越长保留时间越长,k ,k 为为0,0,保留时间为死时保留时间为死时间间. .对A、B两组分的选择因子，用下式表示 上述公式表明：上述公式表明：通过选择因子通过选择因子把实验把实验测量值测量值k k与热力学性质的分配系数与热力学性质的分配系数K K直接直接联系起来，联系起来，对固定相的选择具有实际对固定相的选择具有实际意义。如果两组分的意义。如果两组分的K K或或k k值相等，则值相等，则

18、=1=1，两个组分的色谱峰必将重合，说，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。明分不开。两组分的两组分的K K或或k k值相差越大，值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。分配系数是色谱分离的先决条件。二、塔板理论 最早由最早由MartinMartin等人提出塔板理论，把色等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。标。 该理论假

19、定： （i i）在柱内一小段长度）在柱内一小段长度H H内，组分可以在内，组分可以在两相两相间迅速达到平衡间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板。这一小段柱长称为理论塔板高度高度H H。 （ii ii）以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是）以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是连续进行的，而是脉动式脉动式，每次进气为一个塔，每次进气为一个塔板体积（板体积（VVm m）。）。 （iii iii）所有组分开始时存在于）所有组分开始时存在于第第0 0号号塔板上，而塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。 （iv iv）分配系数在所有塔板上是）分配系数在所有塔

20、板上是常数常数，与组分，与组分在某一塔板上的量无关。在某一塔板上的量无关。. .为简单起见，设色谱往由5块塔板（n5，n为柱子的塔板数）组成，并以r表示塔板编号，r=1，2，nl；某组分的分配比k=1根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下： 开始时，若有单位质量，即m=1（例1mg或1g）的该组分加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。当一个板体积（lV）的载气以脉动形式进入0号板时，就将气相中含有nm部分组分的载气顶到1号板上，此时0号板液相（或固相）中ns部分组分及1号板气相中的nm部分组分，将各自在两相间重新分配。故0号板上所含组分总量

21、为05，其中气液（或气固）两相各为025而1号板上所含总量同样为05气液（或气固）相亦各为025。以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上述过程就重复一次(见下表)。表表2-2 2-2 组分在任一板上的分配情况组分在任一板上的分配情况m m为组分质量，为组分质量，VrVr为保留体积，为保留体积，n n为理论塔板数。为理论塔板数。 当当V=VrV=Vr 时，时，C C值最大，即值最大，即 从上两式可以看出，从上两式可以看出，色谱峰色谱峰Y Y越小，越小，n n就越大就越大，而，而H H就越小，就越小，柱效能越高柱效能越高。因此，。因此，n n和和H H是描述柱效能的指标是描述柱效能的指

22、标。 通常填充色谱柱的通常填充色谱柱的n n10103 3，H H1mm1mm。而毛细管柱。而毛细管柱 n=10n=105 5-10106 6，H H0.5mm0.5mm 由于死时由于死时t tm m包括在包括在trtr中中, ,而实际的而实际的t tm m不参与柱内分配不参与柱内分配, ,所计算所计算的的n n值尽大值尽大,H,H很小很小, ,但与实际柱效能相差甚远但与实际柱效能相差甚远. .所以所以, ,提出把提出把t tm m扣扣除除, ,采用采用有效理论塔板数有效理论塔板数n neffeff和和有效塔板高有效塔板高H Heffeff评价柱效能。评价柱效能。 注意:同一色谱柱对不同物质的柱效能是不一样的同一色谱柱对不同物质的柱效能是不一样的, ,当用这些指标当用这些指标表示柱效能时表示柱效能时, ,必须说明是对什么物质而言必须说明是对什么物质而言. . 塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置，并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置，还提出了计算和评