PNH 阵发性睡眠性血红蛋白尿的流式细胞术检测

1、PNH (paroxysmal nocturnal hemoglobinuria) 是一种罕见的获得性克隆造血干细胞疾病。但近年来有增多趋势。我国北方多于南方。半数以上发生在20-40岁青壮年。男性多于女性，与遗传及种族无关。本病起病隐袭缓慢，呈慢性过程，以贫血、出血为首发症状者较多，以血红蛋白尿起病者较少。 血红蛋白尿 ?睡眠有关，早晨较重，下午较轻 ?尿液外观为酱油或红葡萄酒样; ?伴乏力、胸骨后及腰腹疼痛、发热等 原因 ?因为补体作用最适宜的pH是6.87.O，而睡眠时呼吸中枢敏感性降低，酸性代谢产物积聚 研究历史 ? Strubing第一次报道PNH ? Ham 和Dingle 证明了

2、PNH 患者的红细胞在血清酸化条件下，易发生溶血，这就是现在普遍使用的Ham 实验 ?1983年证实PNH患者GPI合成异常 ?1993年pig-a基因突变 流式细胞术 原理： X染色体上 PIG-A（造血干细胞经获得性体细胞基因）突变 导致糖化肌醇磷脂(GPI)锚合成障碍 导致由GPI锚接在细胞膜上的一组膜蛋白丢失，包括CD16、CD55、CD59等 GPI锚连接蛋白 补体调接蛋白 衰变加速因子(DAF或CD55)、膜攻击复合物抑制因子(MACIF或MIRL或CD59)、补体C8结合蛋白(HRF或C8bp)、膜辅助蛋白(MCP)。 粘附分子 淋巴细胞功能相关抗原 -3(LFA-3或CD58)

3、、 Blast-1/ CD48、CD67、CD66。 GPI锚连接蛋白 酶类 红细胞乙酰胆碱脂酶 ( AchE )、中性粒细胞碱性磷酶酸酶 ( NAP )、5外核酸酶 ( CD 73 )。 受体类 中性粒细胞III型Fc受体 ( FcRIIIb 或CD16 )、单核细胞分化抗原 ( CD14 )、尿激酶型纤溶酶原激活物受体 ( u-PAR )。 血型抗原 CD55 携带的Comer抗原、AchE携带的 Yt抗原。 1型细胞 CD59完全阳性 补体激活途径 C1 C1 C2,C4 C4b2b (C3转化酶） C3 C3b P （备解素） PC3bBb C3bB (C5转化酶） C4b2b3b或P

4、C3bBb C8 C9 C6C7 C5 C5b C5b678 C5b-9 (MAC) CD59 替代途径 经典途径 CD55 Ag-Ab 分析 ?1.红系及粒系FSC/SSC设门 报告标本中CD55、CD59阴性比例 ?做2030份正常人血样划定阳性区（区）范围 ?同型阴性对照界定区范围， ?中间的区域即为区。 ?根据CD59可以将PNH细胞分为3型 ?1型细胞 CD59完全阳性 正常细胞 ?2型细胞 CD59部分阳性 补体中度敏感细胞 ?3型细胞 CD59完全阴性 补体敏感细胞 ?CD55和CD59同时部分或完全缺失是PNH的典型表现，单GPI缺失不能确诊。 ?CD59重要性大于CD55 ?

5、单CD55缺乏时并不因此改变红细胞对补体的敏感性而造成溶血 ?CD59的缺失会增加补体的敏感性 ?临床上以CD59缺失作为诊断标准是一个趋势。 ?解决了一切以补体溶血为基础的实验诊断方法在诊断PNH的不确定性 意义 其它细胞的PNH检测 ?PNH患者的红细胞、粒细胞、单核细胞及淋巴细胞上GPI锚连膜蛋白部分或全部丧失。 ?粒细胞单核细胞淋巴细胞红细胞 ?骨髓PNH克隆出现比外周血早，网织红细胞略早于红细胞 其它细胞的PNH检测 ?应用FSC/SSC设门分析时会有许多脱颗粒的中性粒细胞，这时只使用物理特征无法准确设定粒细胞门了，这时必须使用系列标志/SSC设门:CD15，CD33 。 ?CD64

6、设门，分析单核CD14,CD55,CD59， ?PNH病人检测GPI缺乏的血小板不容易分辨 ?不能只根据淋巴细胞上GPI相关蛋白的表达来诊断。 与其他实验比较 1.酸溶血试验(Ham试验) 患者红细胞与含5%盐酸的正常同型血清混合， pH6.4，37孵育2小时，溶血明显。本试验特异性高，敏感性差。 2.蛇毒因子溶血试验蛇毒因子能通过补体交替途径，使补体敏感的红细胞发生溶血。本试验特异性强，敏感性优于酸溶血试验。 3.热溶血试验和蔗糖溶血试验 因特异性差，常作为筛选方法。 具有PNH克隆的血液病 检测粒细胞GPI 锚连蛋白表达 病种 检测例数 缺失例数( % ) AA 115 25 ( 22 %

7、 ) MDS 39 9 ( 23% ) 并发现 MDS有 PNH表达者 ATG（人胸腺细胞免人胸腺细胞免疫球蛋白）疫球蛋白）治疗有效 ( An Intern Med 1999 ，131: 401 ) PNH和AA关系 相当密切，可以相互转化且并存 AAPNH较多(15%)，PNHAA少 20%30% PNH可伴骨髓再障 AA(ATG治疗后)PNH 1031% AA-PNH综合征 16.5%(我国) 50a外周血或骨髓可检出PNH克隆 AAPNH 生存率要高于PNHAA ?MDS-RA 如捡出PNH克隆者预后好，且ATG(人胸人胸腺细胞免疫球蛋白腺细胞免疫球蛋白 )治疗有效。 PNH对AA和MD

8、S的“自然治疗”，而“AA救了PNH” 。 PNH 克隆见于淋巴增殖性疾病 检测病种 例数 NHL 87 HD 55 红细胞 CD55/CD59 CLL 49 缺失检出率 9.2% ALL 22 HCL 4 (Hematol J 2001，2: 33) PNH克隆见于浆细胞病 检测红细胞 CD55/CD59 缺失 病种 检测例数 缺失例数 (%) MM 62 6 WM 7 2 MGUS 6 1 HCD 2 1 合计 77 10 (12.9%) (Int J Hematol 2002, 75 :40) FLAER ?嗜水气单胞菌溶素变异体(FLAER)。 ?1998年Diep等报道嗜水气单胞菌(

9、HEC)毒素能特异地与细胞膜上GPI锚连蛋白结合，随后立即聚合成多具体，插入细胞膜脂质双层，在膜上形成孔洞致溶破。 ?PNH细胞缺乏GPI蛋白而抵抗毒素保持细胞完好。 FLAER ?FLAER在所有具有GPI锚连蛋白的白细胞上都有特异性表达，所以正常人及非PNH贫血FLAER成100%阳性。 ?是目前诊断PNH最敏感、特异的方法。 ?FLAER对PNH克隆检出的敏感性为0.1%，其它靶向标记检出率的敏感性为1%； 结果分析 ?1.设门 CD45/SSC ?2.标记CD15，CD14，CD45，FLAER 检测PNH粒、单核及淋巴细胞，报告标本中各系细胞FLAER阴性比例 FLAER ?目前FLAER一般用于有核细胞的检测，不能评价红细胞的PNH克隆。 ?由于红细胞表面没有气单胞菌溶素前体产生所需要的蛋白水解酶类，尽管表达在红细胞表