单克隆抗体制备方法

1、单克隆抗体制备方法1975年分子生物学家 G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上， 创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗 原免疫后的纯系小鼠 B细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外 无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这 种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔 接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸 顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所 分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。这项

2、新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性 问题，可用于探讨蛋白质的精细结构；淋巴细胞亚群的表面新抗原；组织相容性抗原；激素和药物的放射免疫（或酶免疫）分析；肿瘤的定位和分类；纯化微生物和寄生虫抗原；免疫治疗和与药物结合的免疫-化学疗法（“导弹”疗法利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合，将药物带至病灶部位。因此，单克隆抗体可直接用于人类疾 病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免 疫治疗开辟了广阔前景。单克隆抗体是由单一 B细胞克隆产生的高度均一、 仅针对某一特定抗原表 位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（ hybridoma ）抗体技术是在 细

3、胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏 B细胞和具有无限 繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为 B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。单克隆抗体是人工制备的杂交瘤细胞生产的，杂交瘤细胞是由一个经抗原激活后的B细胞与一个骨髓瘤细胞融合形成。单克隆抗体优点：纯度高，灵敏 度高，特异性强，交叉反应少，制备的成本低。缺点：对技术有一定的要求， 而且通过抗原的化学处理很容易丢失表位。一、单克隆抗体制备过程1 .免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的

4、免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。2 .细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融 合，形成杂交瘤细胞。3 .选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄喋吟-鸟喋吟-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄喋吟-鸟

5、喋吟-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄喋吟-鸟喋吟-磷酸核糖转移酶， 并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。4 .杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体 的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞 的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗 体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。5

6、 .单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。（1）体内诱生法 取BALB/c小鼠，首先腹腔注射 0.5ml液体石蜡或降植烷进行预 处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并 产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。（2）体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤 细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可 获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术 和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。二、单克隆抗体

7、抗原准备抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体 和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种 ，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与 免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体 制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选 用每只小鼠/大鼠每次注射1050ug重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为 抗原产生特异性的单克隆抗体。1 .动物免疫单克隆抗体制备的宿主动物一般选用BALB/c小鼠，鼠单抗的应用范围相当广泛，一些国内外公司均开发

8、出了兔的单克隆抗体制备技术。免疫原分为可溶性抗原和颗粒性（细胞）抗原，用无菌盐水稀释并与佐剂混合，腹腔注射抗原与佐剂彻底混匀后形成的稳定乳状液，在免疫原提供持续的免疫应答基础上进行加强免疫2 .细胞融合细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法， 如灭活的仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。聚乙二 醇（PEG）,在分子量为 200700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大 于1000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热 稳定，与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量 为4000者，常用浓度为 50%, p

9、H8.0pH8.2 （用10%NaHCO3调整）,分子量 小的PEG,融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。50%浓度，pH偏碱时融合效应最高。也有采用30%- 50%浓度的PEG加上10%二甲亚碉。不同批号的 PEG,即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必 须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的，一般选供 气相色谱用的 PEG。3 .融合过程融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比 例为1:1至10:1不等。3:1或5:1最为常用。三、细胞融合关键A.技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应 答

10、。这必然要失败的。B.融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个无毒无菌的 操作环境。4.杂交瘤细胞克隆化的细胞可以在体外进行大量培养，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。不过体外培养法得到的单克隆抗体有限，其不能超过特定的细胞浓度，且每天要换培养液。而体内杂交瘤细胞繁殖可以克服这些限制。杂交瘤细胞具 有从亲代淋巴细胞得来的肿瘤细胞的遗传特性。如接种到组织相容性的同系小鼠或不能排斥杂交瘤的小鼠（无胸腺的裸鼠），杂交瘤细胞就开始无限地繁殖， 直至宿主死亡。产生肿瘤细胞的小鼠腹水和血清中含有大量的杂交瘤细胞分泌 的单克隆抗体，这种抗体的效价往往高于培养细胞上清液的1001000倍。

11、利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，可以加速和促进 肿瘤的生长。单抗的特异性鉴定可以采用各种方法，如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等，同时还需做免疫阻断试验等。单抗的效价测定可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。不同的测定方法效价不同。培养上清液的效价远不如腹水的效价。采用凝集反应，腹水效价可达 5X104。而采用 ELISA检查，腹水效价可达1.0X106。单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。五、单克隆抗体克隆化方法经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分 泌单克隆抗

12、体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细 胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘 汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。 克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特 定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆 化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般 说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要35次克隆才能稳定。克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分 离法等。单克隆抗体问世以来，由于其独有的特征已迅速应用

13、于医学很多领域。主要表 现在以下几个方面。i .检验医学诊断试剂作为检验医学实验室的诊断试剂，单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性 好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细 胞仪等技术。并且单克隆抗体的应用，很大程度上促进了商品化试剂盒的发展。应用单克隆抗体制作的商品化试剂盒广泛应用于：病原微生物抗原、抗体的检测；肿瘤抗原的检测；免疫细胞及其亚群的的检测；激素测定；细胞因子的测定。单克隆抗体对抗原的识别，与多克隆抗体有很大的不同。不同试剂盒因使用的 单克隆抗体不同，识别抗原的位点不同，导致检测结果有一定差异。因此，标 准化问题还需要进一步研究。2 .蛋白质的提纯单

14、克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质(如Speharose 2B、4B、6B等)上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH,欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。3 .肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。单克隆抗体主要为鼠源性抗体，异种动物血清可引起人体过敏反应。因此，制备人-人单克隆抗体或人源化抗体更为重要，但此方面仍未取得明显进展。七、1 .单克隆抗体的优点(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于