HPLC法测定人血浆中黄酮哌酯活性代谢物MFCA的浓度

1、    HPLC法测定人血浆中黄酮哌酯活性代谢物MFCA的浓度        摘要：目的：建立血浆中黄酮哌酯活性代谢物MFCA浓度测定的HPLC法。方法：血浆样品经碱化、水解及酸化后，用乙酸乙酯提取。以甲醇-20 mmol/L KH2PO4(7030)为流动相，紫外310 nm检测。结果：线性范围0.2532g.ml-1，萃取回收率96.1%100.3%。加样回收率96.8%104.0%，日内RSD0.52%230%，日间RSD1.39%297。结论：本法准确可靠，用于盐酸黄

2、酮哌酯人体药动学研究取得良好结果。关键词：黄酮哌酯；3-甲基黄酮-8-羧酸；HPLC；血药浓度书类号：R969文献标识码：A文章编号：1006-0103(2000)01-0009-03DETERMINATION OF THE ACTIVE METABOLITE OF FLAVOXATEHYDROCHLORIDE(MFCA) IN HUMAN PLASMA BY HPLCHUANG Ying，YU Qin,LIANG Mao-Zhi,（Institute of Clinical Pharmacology of the First University Hospital;）WANG Jian-xi

3、n,（School of Pharmacy，West China University of Medical Sciences ,Chengdu 610041 China）QIN Yong-ping，ZOU Yuan-gao（Institute of Clinical Pharmacology of the First University Hospital;）Abstract：OBJECTIVE：To establish a HPLC method for the determination of 3-methylflavone-8-carboxylic acid(MFCA),the mai

4、n metabolite of flavoxate,in human plasma.METHODS：MFCA and the internal standard were extracted with ethyl acetate after alkali hydrolysis. The mobile phase consisted of methanol and 20 mmol.L1 potassium dihydrogen phosphate(7030).The eluate was monitored at 310 nm.RESULTS：The calibration curve was

5、linear within the range of 0.2532 g.ml-1.The recoveries of extraction were 96.1%1003.The recoveries of methodology were 96.8%104.0%.Within-day RSD ranged from 0.52% to 2.30%.Between-day RSD ranged from 1.39% to 2.97%.CONCLUSION：This method is accurate and reliable.It has been applied successfully to

6、 the determination of MFCA in human plasma for the pharmacokinetic study of flavoxate.Key words：Flavoxate；3-Methylflaveone-8-carboxylic acid；HPLC；Drug concentration in plasmaCLC number：R9Document code：AArticle ID：1006-0103(2000)01-0009-03盐酸黄酮哌酯(flavoxate hydrochloride)是一种平滑肌松驰药，具有选择性解除泌尿生殖道平滑肌痉挛，缓解尿

7、频、尿急、尿痛等膀胱刺激性症状的作用，临床用于泌尿生殖道解痉镇痛取得良好疗效1，2。盐酸黄酮哌脂口服吸收后迅速被代谢，而以其活性代谢物3-甲基黄酮-8-羧酸(3-methylflaveone-8-carboxylicacid,MFCA)为主要存在形式3，4。文献用UV法3、GC法4、毛细管电泳法5检测血浆及尿中MFCA浓度及UV法6测定盐酸黄酮哌酯片剂含量，而HPLC法测定MFCA血药浓度尚未见报道。现建立测定血浆中MFCA浓度的反相HPLC法，并将该法用于盐酸黄酮哌酯人体药动学研究及其制剂生物利用度评价。1材料与方法1.1仪器试药美国Waters公司680型高效液相色谱仪，510型泵，486

8、型紫外检测器；日本Shimadzu 公司C-R7Ae色谱数据处理机；法国Mettler AE 100型电子分析天平。盐酸黄酮哌酯对照品(成都康弘制药有限公司)；3-甲基黄酮-8-羧酸对照品(中国医学科学院药物研究所)；6-甲氧基萘-2-乙酸对照品(6-MNA,中国药品生物制品检定所)；盐酸黄酮哌酯片(吉林制药有限公司，批号960703，规格每片200 mg)；盐酸黄酮哌酯胶囊(成都康弘制药有限公司，批号980105，规格 每粒100 mg)。其余化学试剂均为分析纯。1.2溶液精密称取MFCA对照品6.4mg,加入1 ml0.25mol.L1 NaOH溶解， 用水稀释并定容至50ml，即成MFC

9、A贮备液。临用前以水稀释成所需浓度的MFCA对照品溶液。精密称取盐酸黄酮哌酯对照品9.8 mg(相当于MFCA6.4 mg)，按MFCA贮备液同法配制及稀释，即成盐酸黄酮哌酯对照品溶液。精密称取6-MNA对照品5.0mg，按MFCA贮备液同法配制，即成内标工作液。1.3色谱条件国产YWG ODS(250 mm×4.6mm,10m)分析柱；流动相为甲醇-20 mmol.L1 KH2PO4(7030)，磷酸调缓冲液pH至2.5，流速1.3ml.min1;检测波长310 nm。1.4血样处理取空白血浆200l,加入MFCA对照溶液100l(或待测血浆200 l,加水100 l)、0.25

10、mol.L1 NaOH 100l,于60保温水解10min。再加入1 mol.L1 HCl 100 l及内标工作液100 l(含6-MNA 10g)，用乙酸乙酯1.5ml混旋萃取5 min,3000 r.min1离心5min。将有机相转入离心管，置50水浴通空气流挥干。残渣用流动相60l溶解，进样20l，在前述色谱条件下分离测定。2结果2.1色谱由志愿者口服盐酸黄酮哌酯片200mg后2小时血浆样品色谱(1)可见，内标与MFCA达基线分离且峰形良好，其保留时间分别为4.3min及5.6min。空白血浆中未见杂质峰干扰测定。1MFCA血浆样品色谱Fig 1Chromatogram of MFCA

11、in PlasmaABlankB Sample1 Internal Standard2 MFCA2.2线性关系于空白血浆中加入系列浓度MFCA对照品溶液，使其血浆药浓为0.25、1、4、8、16、24、32 g.ml-1，按“1.4”操作测定。以MFCA与内标峰高的比值(Y)对血浆MFCA浓度(X)进行回归，其直线方程Y=0.1240X-0.0071,r=0.9999。以信噪比3计，血浆MFCA最低检测浓度为0.05 g.ml-1。2.3水解百分率于空白血浆中加入不同浓度的盐酸黄酮哌酯对照品溶液，使相当于MFCA的血浆药浓分别为1、8、16 g.ml-1。按“1.4”项下自“加0.25 mol

12、.L-1 NaOH 100 l”项下操作测定。由MFCA标准曲线求算盐酸黄酮哌酯水解后MFCA的浓度，并计算盐酸黄酮哌酯水解百分率，结果见表1。表1盐酸黄酮哌酯水解百分率(n=5)Table 1Hydrolysed Percentage of Flavoxate hydrochlorideCalculated/g.ml-1Measured/g.ml-1Hydrolysis/%RSD/%1.00.9595.01.658.07.7697.02.8716.015.1594.73.422.4萃取回收率取空白血浆200 l,加入不同浓度的MFCA对照品溶液100 l，按“1.4”操作测定(不加内标)，其

13、MFCA峰高与同浓度MFCA对照品溶液100 l置50水浴挥干后，用流动相60 l溶解进样20 l所得峰高之比，即萃取回收率。浓度为1、8、16 g.ml-1的血浆样品，MFCA萃取回收率(n=6)分别为100.3%，99.2%及96.1%。2.5加样回收率取空白血浆200 l，加入不同浓度的MFCA对照品溶液100 l，按“1.4”操作测定，求出实测量与加入量之比值，即MFCA加样回收率(表2)。 表2MFCA加样回收率(n=6)Table 2Methodology recovery of MFCAAdded/g.ml-1Measured/g.ml-1Recovery/%RSD/%1.01.

14、04104.00.528.07.7496.80.8716.015.6397.72.292.6方法精密度取不同浓度的MFCA血浆样品各数份，按“1.4”项操作，于一日内测定，计算测值的日内RSD；于不同日测定，计算测值的日间RSD(表3)。 表3MFCA日内RSD及日间RSD(n=6)Table 3Within-day and Between day RSD of MFCAConc./g.ml-1Within-day RSD/%Between-day RSD/%1.00.521.398.00.892.7516.02.302.972.7药动学研究10名男性健康志愿者单剂量随机交叉口服盐酸黄酮哌酯片

15、剂或胶囊剂200 mg，分别于服药后0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h采血，用本法测定血浆中MFCA浓度，其均值药-时曲线见2。以3P87药动学程序求出MFCA药动学参数(表4)。盐酸黄酮哌酯胶囊剂对片剂的相对生物利用度为106.23%±5.94%。 210名志愿者口服盐酸黄酮哌酯后MFCA药-时曲线Fig 2MFCA concentration-time curve of 10 volunteers after oral administration表410名志愿者口服盐酸黄酮哌酯后MFCA药动学参数Table 4 MFCA pharmacok

16、inetic parameters of 10 volunteers after oral administrationFactoriesTmax/hCmax/g.ml1T1/2/hAUC/g.ml-1.h-1Tablets0.92±0.2312.98±2.631.09±0.1833.87±4.97Capsule0.83±0.3513.95±2.781.14±0.2735.98±6.923讨论 取志愿者口服盐酸黄酮哌酯片剂及胶囊剂后0.75、1 h血样，用本法不经水解测定原MFCA浓度及经水解测定MFCA总浓度，其

17、原MFCA药浓为水解后MFCA总药浓之88.1%95，与国外文献报道相符4。盐酸黄酮哌酯在该色谱条件下020 min内未见色谱峰。文中采取水解后测定血样中MFCA总药浓，并以之为指标研究盐酸黄酮哌酯人体药动学性质及评价制剂的生物利用度，能更完整地表达盐酸黄酮哌酯被人体吸收利用的情况，是切实合理的。作者简介：黄英(1963-)，女(汉族)，硕士，助理研究员。王建新，华西医科大学1995级博士研究生作者单位：黄英（华西医科大学附一院临床药理研究所）余勤（华西医科大学附一院临床药理研究所）梁茂值（华西医科大学附一院临床药理研究所）王建新（华西医科大学药学院，四川 成都610041）秦永平（华西医科大

18、学附一院临床药理研究所）邹远高（华西医科大学附一院临床药理研究所）参考文献：1Caine M,Gin S ,Pietra C,et al. Antispasmodic effects of flavoxate,MFCA,and Rec 15/2053 on smooth muscle of human prostate and urinary bladderJ.Urology,1991,37(4)3902张志银，孙百鸣，黄以政，等.盐酸黄酮哌酯治疗膀胱刺激症状J.中华泌尿外科杂志，1996，17(10)6383Bertoli M,Conti F,Conti M,et al. Pharmacokinetics of flavoxate in manJ.Pharmacol Res Comm,1976,8(4)4174Ariga T,Tanaka k,Hattori K,et al. Gas chromatographic determination of flavoxate and its metabolites in plasma and urine after oral administration to healthy