免疫磁珠技术在肿瘤学领域的应用

1、免疫磁珠技术在肿瘤学领域的应用         11-03-25 13:37:00     作者：岳巧艳,袁捷     编辑：studa20【摘要】  免疫磁珠是免疫微球的一种,它是包被有单克隆抗体的球型磁性微粒,可特异性地与靶物质结合使之具有磁响应性,可以保证被分离靶细胞的形态和功能的完整,具有灵敏度高、特异性高、检测速度快、重复性好、操作简单和不需要昂贵的仪器设备等优点,本文就该技术应用于肿瘤细胞的分离、富集与检测以及肿瘤

2、的生物学研究和磁导向治疗、免疫磁性净化等领域的研究进展作一综述。 【关键词】  免疫磁珠技术; 循环肿瘤细胞; 免疫磁性净化; 综述Abstract Immunomagnetic beads, a kind of immunomagnetic microspheres, are the spherical magnetic particles coated with monoclonal antibodies, which can specifically combine with the target material and get magnetic responsiveness

3、 and ensure the morphological and functional integrity of the separated target cells. The higher sensitivity and specificity, rapid detection, well repeatability, easier operation and less expensive equipment requirement make this technique more popular. Immunomagnetic beads have gradually been appl

4、ied to the separation, enrichment and detection of tumor cells, as well as to tumorous biological research and targeted therapy, immunomagnetic purification and other fields.Key words immunomagnetic beads; circulating tumor cells; immunomagnetic purification; review免疫磁珠(immunomagnetic bead, IMB)技术是近

5、年来国内外研究的一种新的免疫学技术。IMB是免疫微球的一种,为包被有单克隆抗体的球型磁性微粒,可特异性地与靶物质结合使之具有磁响应性。该技术由John Ugelstar等于1979年首先制备出,从此被广泛地应用于医学卫生领域的许多方面,并由此引发了生物分离技术上的一次革命。1 IMB技术的基本原理IMB是一些以金属小颗粒为核心的微球,其外层可以根据需要包被不同的免疫活性物质(抗原、抗体等),使其结合样本中具有相应免疫配基的靶细胞;再利用磁场的作用把这些磁珠与靶细胞的复合体分离出来。IMB技术区别于PCR技术和流式细胞技术的一个最明显的优势在于,它可以保证被分离靶细胞的形态和功能的完整。免疫磁珠

6、技术同时还具有灵敏度高、特异性高、检测速度快、重复性好、操作简单和不需要昂贵的仪器设备等优点。用IMB技术进行分离细胞有两种方式:直接从细胞混合液中分离出靶细胞的方法称为阳性分离;用IMB去除无关细胞使靶细胞得以纯化的方法称为阴性分离。2 肿瘤细胞的分离、富集与检测肿瘤的转移和浸润是影响肿瘤患者预后的重要因素,易导致肿瘤的复发和转移,且早期即可发生,所以早期实体肿瘤也被认为是全身性疾病。IMB技术应用于肿瘤学可以确定临床分期、监测术后患者肿瘤复发与转移、评估预后、选择个体化的治疗策略。基于IMB技术可以分离有活性特异细胞的基本原理,IMB技术广泛应用于肿瘤细胞的分离、富集与检测。根据肿瘤细胞不

7、同的生物学特性,先将特异的抗体标记在磁珠上,通过肿瘤细胞特异性抗体对肿瘤细胞表面抗原的特异识别,在磁场作用下达到分离细胞的目的。这样,肿瘤特异性抗原不仅被用来区分肿瘤细胞与正常细胞,还被用来将肿瘤细胞富集起来,大大增加了检测的敏感性。分离肿瘤细胞的关键在于包被磁珠的特异性标记的选择。常用的肿瘤细胞的检测标记有细胞角蛋白、癌胚抗原、基质金属蛋白酶和端粒酶等。IMB特异性标记的选择直接关系到肿瘤细胞分离的灵敏度和特异性。阴性选择法利用IMB去除无关细胞从而使肿瘤细胞得以富集、纯化,主要的优点在于其不依赖肿瘤细胞表达特异性标记。IMB在肿瘤细胞分离中的应用主要表现在以下几个方面：2.1 外周血中肿瘤

8、细胞的检测大量证据表明,原发肿瘤在早期就有肿瘤细胞脱落到循环系统,这些脱落的肿瘤细胞是常用的检测手段很难检测到的,被称为循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)、外周血微转移等。肿瘤治疗失败的主要原因就在于不能早期发现并控制患者体内存在的播散性的微小转移。袁捷等1在32例胃癌患者的外周血中发现有13例可以检出微量的胃癌细胞,且与胃癌的浸润深度、有无区域淋巴结转移和有无远处转移相关,提示外周血微转移与胃癌的进展过程相一致,可能是胃癌进展与转移的早期行为。Nakamura等2通过IMB技术检测了循环血液中的食管癌细胞。他们采用了BerEP4共价结合的磁珠与抗细胞角蛋白

9、(CK)抗体对47名原发性食管癌患者的外周血标本进行检测,结果显示在47名患者中有18名可以检测到CK反应性细胞,其检测率与病期(TNM分期)紧密相关(P=0.001 7)。Denis等3利用IMB技术与RTPCR相结合的方法可以检测到1 ml血液中的1个肠癌细胞。同样Makarovskiy等4采用相似的方法可以检测到8 ml血液中少于10个的前列腺癌细胞。目前国内已有学者开始利用IMB技术进行实体肿瘤外周血微转移的研究56。2.2 胸腹水中肿瘤细胞的检测胸腹水是常见的临床病症。胸腹水脱落细胞学检查不仅具有确诊意义,而且有可能根据该细胞的性质推断其来源,从而找到原发病灶,是胸腹水临床诊断的重要

10、依据。但常规的脱落细胞涂片检查由于种种因素的影响, 存在一定的假阴性和假阳性, 诊断阳性率较低。IMB技术可以保持靶细胞的完整形态。该特性使得免疫磁珠技术可以从胸腹水中分离、富集出相应的靶细胞群后再对其进行细胞学检查。王文秀等7应用此方法与常规涂片方法分别对30例癌症患者的胸腹水进行脱落细胞检查的对照研究,结果两组阳性率分别为63.3%及23.3%,且前者结果包含后者结果,差异有显著性(P<0.01)。Sapi等8利用IMB技术阳性选择法从卵巢癌患者腹水中富集出肿瘤细胞,结果显示阳性率为83%(15/18)。有报道用IMB技术可以检测肺癌患者痰液中脱落的癌细胞9、膀胱癌患者尿液中的肿瘤细

11、胞10。其他标本如胸腔冲洗液、腹腔冲洗液、胰液、粪便等的研究也在进行中。2.3 骨髓中肿瘤细胞的检测骨髓中出现恶性细胞,可能预示着肿瘤的早期复发,同时微转移细胞的数量及表型是判断转移灶是否进展的重要指标。Flatmark等11用IMB可在3 h 内从含2×107个单核细胞的骨髓中筛选出微转移的结直肠癌细胞。王贵英等12应用免疫磁珠富集技术研究胃癌骨髓微转移细胞的形态学分类并发现胃癌骨髓微转移细胞数与肿瘤的TNM分期有关,认为对此类患者进行术前术后的辅助化疗及其他形式的综合治疗是非常必要的。2.4 淋巴结中肿瘤细胞的检测淋巴转移是肿瘤转移的主要方式,淋巴结转移也是重要的预后指标,因此研

12、究肿瘤淋巴转移具有重要的临床意义。使用敏感的方法来检测哨兵淋巴结的微转移还可以避免不必要的淋巴结清扫和清扫之后并发症。应用IMB技术检测淋巴结中肿瘤细胞的原理是把淋巴结组织经过胰酶、蛋白水解酶等处理后,使之变成细胞悬液后应用免疫磁珠的方法进行分离,然后镜下观察细胞群中有无肿瘤细胞。这样不仅灵敏度高于常规病理检查,而且可以防止由于切片的问题而遗漏恶性细胞。但它不能像根治术前、中的淋巴结染色那样能够指导手术、明确术中清除淋巴结的范围,其临床应用受到了一定限制。3 肿瘤生物学研究即利用分离纯化后的肿瘤细胞仍具有良好的生物学特性的特点13,可对肿瘤细胞、基质细胞或者移植干细胞进行传代和克隆培养以研究其

13、生物学特性,将有助于深入了解肿瘤组织的生物学本质及其引起复发转移的发生机制及干细胞移植后在体内的反应,为阻断肿瘤的生长、转移及移植治疗提供理论依据和方法。付军等14用IMB的方法从脑胶质瘤组织中分离出脑胶质瘤干细胞从而为深入研究脑胶质瘤的生物学特性奠定基础。李虹等15已成功地用直接磁分选技术分离出鼻咽癌组织中的T淋巴细胞, 为进一步肿瘤基质的分子生物学研究奠定了良好的基础。 颜政等16采用IMB方法分离出被认为是肝癌的源细胞的肝内卵圆细胞亚群,把合适浓度的细胞悬液注射到裸鼠腋背部皮下, 观察裸鼠移植肿瘤生长情况,从而评价其生物学行为。4 肿瘤的治疗4.1 磁导向治疗磁导向治疗是将抗癌药物偶联在IMB的表面使其形成一整体,共同进入体内血管后在足够强的磁场引导下,选择性地到达并集中定位于肿瘤区。药物以受控方式从载体中释放,然后发挥药效作用。将单克隆抗体与磁性微球连接,还可达到主动靶向的目的。这种免疫磁性微球选择性较高,对非靶组织器官影响小;可增加局部的化疗药物浓度及药效维持时间;聚集后还能在肿瘤血管起到栓塞作用,为临床肿瘤治疗提供了有效的治疗途径,已成