青霉菌固体发酵三七药材的活性成分变化研究

1、青霉菌固体发酵三七药材的活性成分变化研究（8683）三七Panax notoginseng (Burk).F.H.Chen为五加科人参属多年生草本植物，用于治疗疾病已有悠久历史,是我国的传统珍贵药材1。现代药理研究表明,三七具有活血、止血、保护心肌、降血糖、提高记忆力、滋补强壮、免疫调节等疗效2-3。在临床上可应用于治疗血栓、心脑血管疾病、肝炎、顽固性头痛等。三七总皂苷(PNS)是三七中主要的生理活性成分，含量在三七中高达6%4，是三七发挥药效的主要成分5，其中尤以含量较低的稀有皂苷活性较强，生物利用度较高，对于诱导肿瘤细胞凋亡6、逆转白血病细胞耐药7、调节蛋白激酶C的活性8及抑制肿瘤细胞的增

2、殖9等都具有很好的疗效，因此，如何提高稀有皂苷的含量就成为了三七药材深度开发利用的热点内容。利用微生物对中药材进行生物转化目前已经可以成熟的应用到中药炮制和加工的领域中，通过中药发酵可以达到改变药材的物质基础，提高有效成分含量，降低毒副作用等目的。青霉菌（Penicillium sp.）是环境中的常见菌种，生长速度快，环境适应能力强，且生物安全性较高，非常适用于在中药基质上生长10-14；本课题组前期发现三七药材自然贮存过程中，非常容易感染青霉。本实验首先利用青霉菌对三七药材进行发酵，然后采用LC-MS方法，对青霉菌发酵三七药材过程中，主要活性成分的变化进行检测，考察稀有皂苷的产生和积累过程，

3、为指导三七药材的开发和利用以及稀有皂苷的大规模生产提供理论依据。2 材料与方法2.1 实验材料Agilent 1260 高效液相 (Agilent Technologies, USA)、Agilent 6520 Q-TOF 质谱仪(Agilent Technologies, USA)；生物安全柜（Thermo scientific 1300 A2）；恒温恒湿培养箱（金坛市天竟实验仪器厂）； TG328A（S）分析天平（ 北京斯达恒通科技有限公司）； 立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；真空干燥箱（DZF-6090）；高速万能粉碎机（FW100型）；药典筛一、四号（浙江上虞市五

4、四仪器厂）；广口三角瓶（250ml）。乙腈、甲醇为色谱纯（Thermo scientific），甲酸为质谱纯（Sigma），其他化学试剂均为分析纯（北京化工厂）。青霉菌（CICC 2515）购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，复苏后先于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上扩繁，积累到一定生物量后，4斜面保存，备用。2.2 实验方法2.2.1 三七药材固体发酵三七药材粉碎（过1号筛），加入60%（V/W）的蒸馏水水，搅拌均匀，分装于250ml广口瓶中，放入高压蒸汽灭菌器中保持温度121，灭菌60min，取出，自然冷却至室温，在生物安全柜中接种青霉菌适量，待接种完成后放入温度为28，湿度65%的恒温

5、恒湿培养箱中，培养20天，备用。2.2.2发酵产物分析2.2.2.1 对照品溶液的制备精密称定人参皂苷Rh1、人参皂苷F1、人参皂苷Rg3、人参皂苷F2、人参皂苷Rh2和人参皂苷CK对照品适量，用甲醇溶解稀释成每1 mL含单体皂苷各0.03mg的溶液，即为对照品溶液。2.2.2.2发酵产物及对照药材样品的制备 取2.2.1项下发酵产物，置于减压真空干燥箱干燥，粉碎。取本品粉末、三七药材粉末（过四号筛）0.2g，精密称定，精密加入甲醇4ml，称定重量，超声处理60min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，0.22um滤膜过滤，备用。2.2.3 分析条件的选择2.2.3

6、.1色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX SB-AQ (4.6×250 mm，5 um)流速：1.0ml/min；柱温：室温；检测波长：203nm；进样量：10ul洗脱条件：见表1表1 色谱洗脱条件Table 1 Chromatographic condition时间（min）0.1%甲酸乙腈(%)0.1%甲酸水(%)0351981355519298171557029717010029407160100120409060102.2.3.2质谱条件离子源：ESI；电离模式：Negative；喷雾器压力：30 psi；干燥气（N2）流速：10 L/min；干燥气温度：350；毛细

7、管电压：3500V；碎裂电压：175V；锥孔电压：65V；质量检测范围(m/z）：300-1400；数据分析软件：Agilent MassHunter Workstation software-Qualitative Analysis (version B.04.00, Build 4.0.479.5, Service Pack 3, Agilent Technologies, Inc. 2011)。2.2.4 方法学考察2.2.4.1精密度考察 取同一供试品溶液，按2.2.3项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，并计算共有峰与特征峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，计算RSD值。结果表明共

8、有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%，说明该方法精密度符合要求。2.2.4.2 重复性考察 取同一批次三七发酵产物样品6份，依2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.3项下色谱条件测定，记录色谱图，并计算共有峰与特征峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，计算RSD值。结果表明共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%，说明该方法精密度符合要求。2.2.4.3 稳定性考察 取同一供试品溶液分别于制备后0，2，4，6，8，10h按2.2.3项下色谱条件测定，记录色谱图，并计算共有峰与特征峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，计算RSD值。结果表明共有峰的相对保留时间和相

9、对峰面积的RSD值均小于3%，说明供试品溶液在10h内稳定性良好。3 结果3.1 色谱峰归属由图1可知，三七药材经青霉菌固体发酵后主要活性成分发生较大变化。根据分子量和结构裂解规律，我们推断1-12号色谱峰均为皂苷类成分。通过查阅大量文献15-19对皂苷类成分的分子量、极性的大小及相对保留时间，进行归纳总结，将色谱峰1、2、3、6、8、9分别指认为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd和Rh4；经过标准品对照，色谱峰4、5、10、11和12分别鉴定为Rh1、F1、F2、Rg3和CK；色谱峰7的m/z = 637.4451 M-H-，计算分子式为C36H62O9，是人参皂苷Rh1和F1

10、的同分异构体，根据三七及其加工产品成分分析的文献报道，推测该化合物为Sanchinoside B1 20。具体的色谱峰归属结果见表2。图1 混标和发酵产物MS总离子流图Figure 1 MS total ion chromatogram (TIC) of the mixed standards and fermentation product表2 色谱峰指认Table 2 Identification of the chromatographic peaksSequence numberTimeM-HIdentification125.98931.5347R1233.76799.5020Rg1

11、341.23945.5500Re467.02637.4463Rh1 571.54637.4479F1 679.851107.5915Rb1783.27637.4451Sanchinoside B1889.60945.5498Rd997.28619.4359Rh410105.48783.4971F211106.52783.4962Rg312111.92621.4526CK3.2 药材及发酵产物皂苷含量变化由图2可以看到，三七药材经过发酵之后，原生苷R1、Rg1、Re以及Rb1的含量均有不同程度的降低，而极性较低的稀有皂苷含量均有大幅度的提高；通过液质联用的定量模式，记录不同色谱峰发酵前后的峰面积

12、变化（结果见表3），并利用下面的公式计算含量变化百分比：含量变化（%）=三七发酵产物峰面积三七药材峰面积×100%三七药材峰面积结果表明：三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1经发酵后含量分别降低64.15%、6.89%、1.99%、87.84%；而人参皂苷Rd和F2的含量提高显著，分别提高161.20%和372.35%；同时，在青霉发酵后的三七中检出了稀有皂苷F1、Sanchinoside B1、人参皂苷Rg3和人参皂苷CK。图2 三七发酵前后总离子流图对比Figure 2 TIC comparison between panax notoginseng and

13、 the fermentation product表3 药材及发酵产物皂苷峰面积Table 3 Peak areas of different saponins in panax notoginseng and the fermentation product序号皂苷名称三七药材峰面积（Intensity）三七发酵产物峰面积（Intensity）1R121924327860252Rg132043845298342333Re164243916096814Rh11877475136827055F152746756Rb176550019309137SanchinosideB160788398Rd15

14、7898141243429Rh4378989910F2523449247253311Rg373551212CK3650685注：“”未检出。4 讨论通过上述实验结果，我们得出青霉菌可以对三七药材中皂苷类成分进行转化，并提高稀有皂苷含量，使得到的发酵产物展现出较高的临床应用价值和挖掘潜力，为指导三七药材的开发和利用以及稀有皂苷的大规模生产提供理论依据。然而，利用提取离子模式（EIC）对特定分子量的黄曲霉素和赭曲霉素进行检测，并未发现明显的微生物毒素产生，推测可能是在三七药材基质上生长抑制了青霉合成微生物毒素的能力，因此，利用青霉菌发酵三七，提高活性成分含量，改造药材品质具有一定的可行性。参考文献

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